構造と生物物理学のためのRNA結合タンパク質の公平で効率的なセグメント標識の方法

ほとんどの真核生物RNA調節因子は、いくつかのRNA結合ドメインの組み合わせ使用により、RNAおよびタンパク質パートナーを認識しています。ドメイン間のダイナミクスと相互作用は、認識に重要な役割を果たし、個々の相互作用に関する情報を誘惑することができれば、NMRやFRETなどの手法によって分析できます。標識されたラベル付きのペプチドチェーンを結紮することにより、タンパク質を分節的に標識することで、不要な情報を除外し、標識された部分のみを観察することができます。2つのタンパク質フラグメントを結び付けるためにいくつかの戦略が実装されていますが、2つ以上のドメインのタンパク質を分割するために必要な複数のリガエーションは、より挑戦的であり、ドメインの構造と溶解度に依存することがよくあります。ここでは、要件に応じて、内部ドメインとエンドドメインの両方の高速で高収量の標識を可能にする複数のタンパク質セグメントを連結する方法を報告します。最適化された反応環境でTCEPとメルカプトフェニル酢酸（MPAA）を使用して、その構造または溶解度とは独立してタンパク質ドメインの効率的な結紮を実現します。この方法は、RNA調節における組み合わせタンパク質RNA認識の分子研究に有用なツールを提供すると予想しています。

Most eukaryotic RNA regulators recognise their RNA and protein partners by the combinatorial use of several RNA binding domains. Inter-domain dynamics and interactions play a key role in recognition and can be analysed by techniques such as NMR or FRET, provided that the information relative to the individual interactions can be de-convoluted. Segmentally labelling the proteins by ligating labelled and unlabelled peptide chains allows one to filter out unwanted information and observe the labelled moieties only. Several strategies have been implemented to ligate two protein fragments, but multiple ligations, which are necessary to segmentally label proteins of more than two domains, are more challenging and often dependent on the structure and solubility of the domains. Here we report a method to ligate multiple protein segments that allows the fast, high yield labelling of both internal and end domains, depending on the requirements. We use TCEP and mercaptophenylacetic acid (MPAA) in an optimised reaction environment to achieve an efficient ligation of protein domains independently from their structure or solubility. We expect the method will provide a useful tool for the molecular study of combinatorial protein-RNA recognition in RNA regulation.