モデルのヒト単球およびマクロファージにおけるP2X4受容体依存性Ca2+流入

単球とマクロファージは、アデノシン5'-三リン酸（ATP）の細胞表面p2受容体のレパートリーを発現します。これは、直接透過（イオントロピックP2X受容体）または細胞内カルシウム貯蔵（代謝物P2Y受容体）の動員によって達成されます。ここでは、モデルのヒト単球およびマクロファージにおけるATP誘発カルシウム応答におけるP2X4受容体活性化の寄与を調査するための並んで比較しました。p2x1、p2x4、p2x5、p2x7の発現は、モデル単球とマクロファージの両方でqrt-pcrおよび免疫細胞化学によって確認されました。ATPは、THP-1単球とマクロファージの両方で細胞内カルシウムの濃度依存性の増加を引き起こしました。THP-1単球の最大ATP濃度（100μM）に対するSARCO/小胞体Ca2+-ATPase阻害剤Thasigargin（TG）応答、およびマクロファージの反応は有意に減衰しました。モデルマクロファージのTG耐性ATP誘発カルシウム応答は、細胞外カルシウムに依存しており、カルシウム流入の必要性を示唆しています。イベルメクチン（IVM）は、Tg耐性成分の大きさを増強し、モデルマクロファージの反応の減衰を遅くしました。TG耐性成分は、P2X4拮抗薬5-BDBDおよびPSB-2062によって減衰しましたが、P2X1拮抗薬RO0437626またはP2X7拮抗薬A438079によっては減衰しませんでした。shRNAを介したP2X4ノックダウンにより、TG耐性ATP誘発カルシウム応答が大幅に減少し、P2X4特異的薬理学的ツール、IVMおよびPSB-2062に対する感度が低下しました。ダイナソアによるエンドサイトーシスの阻害は、TG耐性成分の大きさを大幅に減少させましたが、崩壊応答が大幅に遅くなりました。ワキオリン-1によるカルシウム依存性エキソサイトーシスの阻害は、TG耐性成分に影響を与えませんでした。これらの薬理学的データは、P2X4受容体の活性化が、モデルのヒトマクロファージのATPによって引き起こされるイオノトロピックカルシウム応答に大きく寄与したことを示唆しています。

Monocytes and macrophages express a repertoire of cell surface P2 receptors for adenosine 5'-triphosphate (ATP) a damage-associated molecular pattern molecule (DAMP), which are capable of raising cytoplasmic calcium when activated. This is achieved either through direct permeation (ionotropic P2X receptors) or by mobilizing intracellular calcium stores (metabotropic P2Y receptors). Here, a side-by-side comparison to investigate the contribution of P2X4 receptor activation in ATP-evoked calcium responses in model human monocytes and macrophages was performed. The expression of P2X1, P2X4, P2X5 and P2X7 was confirmed by qRT-PCR and immunocytochemistry in both model monocyte and macrophage. ATP evoked a concentration-dependent increase in intracellular calcium in both THP-1 monocyte and macrophages. The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase inhibitor thasigargin (Tg) responses to the maximal ATP concentration (100 μM) in THP-1 monocytes, and responses in macrophage were significantly attenuated. Tg-resistant ATP-evoked calcium responses in the model macrophage were dependent on extracellular calcium, suggesting a requirement for calcium influx. Ivermectin (IVM) potentiated the magnitude of Tg-resistant component and slowed the decay of response in the model macrophage. The Tg-resistant component was attenuated by P2X4 antagonists 5-BDBD and PSB-12062 but not by the P2X1 antagonist Ro0437626 or the P2X7 antagonist A438079. shRNA-mediated P2X4 knockdown resulted in a significant reduction in Tg-resistant ATP-evoked calcium response as well as reduced sensitivities towards P2X4-specific pharmacological tools, IVM and PSB-12062. Inhibition of endocytosis with dynasore significantly reduced the magnitude of Tg-resistant component but substantially slowed decay response. Inhibition of calcium-dependent exocytosis with vacuolin-1 had no effect on the Tg-resistant component. These pharmacological data suggest that P2X4 receptor activation contributed significantly towards the ionotropic calcium response evoked by ATP of the model human macrophage.