HIF（FIH）を阻害するα-ケトグルタル酸依存性オキシゲナーゼ因子における溶媒トンネルの役割に関する調査

非ヘムFe（II）/α-ケトグルタル酸（αKG）依存性のオキシゲナーゼは、αKGの酸素酸素化への酸化脱炭酸を結合することにより、幅広い反応を触媒します。このクラスの酵素は、O2が一次基質を結合した後にのみ反応する連続メカニズムに従い、タンパク質構造を調整する方法について疑問を提起します。低酸素誘発性因子を阻害する酵素「因子」（FIH）は、C末端トランス活性化ドメイン（CTAD）をヒドロキシル化することによりヒト細胞のPO2を感知し、活性部位への分子アクセスを制限する構造要素がPO2応答を制限する可能性があることを示唆しています。この研究では、FIHの活性部位への分子アクセスに対するFIHの溶媒にアクセス可能なトンネルの影響をテストしました。トンネルのサイズは、アラニン点突然変異誘発（Y93A、E105A、およびQ147A）を介して増加し、その後、機械的および分光プローブのスイートを使用しました。O2またはCTADを変化させる定常状態の速度論は、トンネルを通るO2の通過がALA置換の影響を受けなかったことを示しており、この狭いトンネルはFIHによるPO2センシングに影響を与えないと結論付けることができました。さまざまなαKG濃度を持つ定常状態の速度論により、ALA変異体の基質阻害の増加が明らかになり、2番目のαKG分子がFIHの活性部位の近くで結合する可能性があることを示唆しています。この溶媒にアクセス可能なトンネルがO2エントリトンネルである場合、αKGなどの代謝中間体が生理学的条件下でFIHを阻害することを防ぎながらO2アクセスを許可するために狭くなる可能性があります。

Non-heme Fe(II)/α-ketoglutarate (αKG)-dependent oxygenases catalyze a wide array of reactions through coupling oxidative decarboxylation of αKG to substrate oxygenation. This class of enzymes follows a sequential mechanism in which O2 reacts only after binding primary substrate, raising questions over how protein structure tailors molecular access to the Fe(II) cofactor. The enzyme "factor inhibiting hypoxia inducible factor" (FIH) senses pO2 in human cells by hydroxylating the C-terminal transactivation domain (CTAD), suggesting that structural elements limiting molecular access to the active site may limit the pO2 response. In this study, we tested the impact of a solvent-accessible tunnel in FIH on molecular access to the active site in FIH. The size of the tunnel was increased through alanine point mutagenesis (Y93A, E105A, and Q147A), followed by a suite of mechanistic and spectroscopic probes. Steady-state kinetics varying O2 or CTAD indicated that O2 passage through the tunnel was not affected by Ala substitutions, allowing us to conclude that this narrow tunnel did not impact pO2 sensing by FIH. Steady-state kinetics with varied αKG concentrations revealed increased substrate inhibition for the Ala variants, suggesting that a second αKG molecule may bind near the active site of FIH. If this solvent-accessible tunnel is the O2 entry tunnel, it may be narrow in order to permit O2 access while preventing metabolic intermediates, such as αKG, from inhibiting FIH under physiological conditions.