o-フタラルデヒドによる柱式誘導体化を含むHPLCによる生物学的サンプルにおけるグルタチオンの分析

グルタチオン（GSH）は、原核生物および真核生物のポリアミンと共役を形成します。また、特に酸化ストレスの条件下で、細胞の恒常性と機能を調節するために、GSHとポリアミンの間のクロストークを示唆する証拠もあります。細胞代謝と機能における汎用性の高い役割により、グルタチオン分析のために多くの高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）方法が開発されています。ここでは、o-column誘導体（OPA）による前column誘導体化を含むHPLCによる、動物組織および細胞におけるGSHおよび酸化型のグルタチオン（GS-SG）の分析のための迅速かつ敏感な方法について説明します。OPAは、オートサンプラーで室温でS-カルボキシメチル - グルタチオン（20-25°C）でS-カルボキシメチル - グルタチオンと非常に迅速に（1分以内）反応し、それらの誘導体は抽出を必要とせずにすぐにHPLCカラムに注入されます。この方法では、サンプルがオートサンプラーにロードされる前に、2つの簡単なステップ（合計15分）が必要です。（a）2-メルカプトエタノールによるGS-SGへの変換。（b）S-カルボキシメチル - グルタチオンを生成するためのヨード酢酸によるGSHの酸化。オートサンプラーは、S-カルボキシメチル - グルタチオンとOPAを1分間混合するようにプログラムされており、HPLC分離と検出のために高度に蛍光誘導体を生成します（励起波長340 nmおよび発光波長450 nm）。GSHおよびGS-SGの検出限界は、15 pmol/mlまたは375 fmol/噴射です。クロマトグラフィー分離の合計時間（カラム再生を含む）は、各サンプルで16分です。当社の日常的なHPLC技術は、システインとシスチンの分析、および生物学的サンプルのポリアミンとGSH-ポリアミンのコンジュゲートに適用できます。

Glutathione (GSH) forms conjugates with polyamines in prokaryotes and eukaryotes. There is also evidence suggesting cross-talk between GSH and polyamines to regulate cellular homeostasis and function, particularly under the conditions of oxidative stress. Because of its versatile roles in cell metabolism and function, a number of high performance liquid chromatography (HPLC) methods have been developed for glutathione analysis. Here, we describe our rapid and sensitive method for the analysis of GSH and the oxidized form of glutathione (GS-SG) in animal tissues and cells by HPLC involving pre-column derivatization with o-phthalaldehyde (OPA). OPA reacts very rapidly (within 1 min) with S-carboxymethyl-glutathione at room temperatures (e.g., 20-25 °C) in an autosampler, and their derivatives are immediately injected into the HPLC column without any need for extraction. This method requires two simple steps (a total of 15 min) before samples are loaded into the autosampler: (a) the conversion of GS-SG into GSH by 2-mercaptoethanol; and (b) the oxidation of GSH by iodoacetic acid to yield S-carboxymethyl-glutathione. The autosampler is programmed to mix S-carboxymethyl-glutathione with OPA for 1 min to generate a highly fluorescent derivative for HPLC separation and detection (excitation wavelength 340 nm and emission wavelength 450 nm). The detection limit for GSH and GS-SG is 15 pmol/ml or 375 fmol/injection. The total time for chromatographic separation (including column regeneration) is 16 min for each sample. Our routine HPLC technique is applicable for analyses of cysteine and cystine, as well as polyamines and GSH-polyamine conjugates in biological samples.