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角縁幹細胞（LSC）のex vivo培養は、眼表面の再構築のための現在の有望なアプローチです。これに関連して、3T3フィーダー層細胞（マウス胚線維芽細胞）は一般に、LSCを維持および拡張するために利用されます。この研究の目的は、LSCの幹の維持に重点を置いて、3T3細胞の代わりに臍帯由来のヒト無制限の体幹細胞（HUSSC）を使用して、LSCを拡大するために、新しい培養法（動物由来の製品を無料）を開発することです。フロークリトメーターを使用して、分離されたHUSSCは、CD105、CD90、CD166、CD34、CD45、CD31細胞表面マーカー、および脂肪生成系統への分化能力を評価しました。コロニー形成効率（CFE）、上皮系統の分化、および核型に加えて、LSC特性は、定量的RT-PCR（QRT-PCR）と免疫化結石化学を使用したABCG2、ΔNP63-α、CK19、CK3、およびCK12 MRNAおよびタンパク質発現について評価されました。、これらの細胞をHUSSCと共培養した場合（3T3フィーダー層と比較して）。HUSSCと共培養されたLSCは、正常な核型（46、XX）を示しましたが、コロニー（86±3）を効率的に形成し（86±3）、角質上皮分化遺伝子の幹とダウンレギュレーションに関連する遺伝子のアップレギュレーションを示すことができました。3T3フィーダーセルと一致して、紡錘形の形態とクイック分割特性を備えたHUSSCは、LSCのステムのような細胞表現型を保存する能力を持っていました。これらの発見は、QRT-PCRおよびフロークリトメーターによって確認されました。現在の研究の発見は、LSCの成長と幹を生体内培養培養を維持するために、3T3フィーダー層細胞の有望な代替方法としてHUSSCを示唆しています。
角縁幹細胞（LSC）のex vivo培養は、眼表面の再構築のための現在の有望なアプローチです。これに関連して、3T3フィーダー層細胞（マウス胚線維芽細胞）は一般に、LSCを維持および拡張するために利用されます。この研究の目的は、LSCの幹の維持に重点を置いて、3T3細胞の代わりに臍帯由来のヒト無制限の体幹細胞（HUSSC）を使用して、LSCを拡大するために、新しい培養法（動物由来の製品を無料）を開発することです。フロークリトメーターを使用して、分離されたHUSSCは、CD105、CD90、CD166、CD34、CD45、CD31細胞表面マーカー、および脂肪生成系統への分化能力を評価しました。コロニー形成効率（CFE）、上皮系統の分化、および核型に加えて、LSC特性は、定量的RT-PCR（QRT-PCR）と免疫化結石化学を使用したABCG2、ΔNP63-α、CK19、CK3、およびCK12 MRNAおよびタンパク質発現について評価されました。、これらの細胞をHUSSCと共培養した場合（3T3フィーダー層と比較して）。HUSSCと共培養されたLSCは、正常な核型（46、XX）を示しましたが、コロニー（86±3）を効率的に形成し（86±3）、角質上皮分化遺伝子の幹とダウンレギュレーションに関連する遺伝子のアップレギュレーションを示すことができました。3T3フィーダーセルと一致して、紡錘形の形態とクイック分割特性を備えたHUSSCは、LSCのステムのような細胞表現型を保存する能力を持っていました。これらの発見は、QRT-PCRおよびフロークリトメーターによって確認されました。現在の研究の発見は、LSCの成長と幹を生体内培養培養を維持するために、3T3フィーダー層細胞の有望な代替方法としてHUSSCを示唆しています。
Ex vivo culture of limbal stem cells (LSCs) is a current promising approach for reconstruction of the ocular surface. In this context, 3T3 feeder layer cells (mouse embryo fibroblast) are generally utilized to maintain and expand LSCs. The aim of this study is to develop a novel culture method (animal-derived products free) to expand LSCs, using umbilical cord derived human unrestricted somatic stem cells (hUSSCs) instead of 3T3 cell with an emphasis on maintaining of the Stemness in LSCs. Using flow-cytometer, isolated hUSSCs were characterized for CD105, CD90, CD166, CD34, CD45, CD31 cell surface markers and their differentiation capability into adipogenic as well as osteogenic lineages were evaluated. In addition to colony-forming efficiency (CFE), epithelial lineage differentiation and karyotyping, LSC properties were evaluated for ABCG2, ΔNP63-α, CK19, CK3, and CK12 mRNA and protein expressions using quantitative RT-PCR (qRT-PCR) and immunocytochemistry, when these cells were co-cultured with hUSSCs (in comparison with 3T3 feeder layer). LSCs, co-cultured with hUSSCs, showed normal karyotype (46, XX), while they could efficiently form colony (86 ± 3) and display up-regulation of the genes associated with stemness and down-regulation of corneal epithelial differentiation genes. Consistent with 3T3 feeder cells, hUSSCs with spindle-shaped morphology and quick splitting up properties had ability to preserve the stem like-cell phenotype of LSCs. These findings were confirmed by qRT-PCR and flow-cytometer. Findings of present study suggest hUSSCs as a promising alternative method for 3T3 feeder layer cells, to preserve growth and stemness of LSCs ex vivo culture.
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