スプリットルシフェラーゼ技術に基づいて、ビタミンD受容体アゴニストと拮抗薬を検出および識別する非常に敏感なin vitroシステムの開発

スプリット - ルシフェラーゼ技術は、いくつかのホルモンやビタミンを含むタンパク質間相互作用と生物活性小分子を検出するために広く使用されています。以前は、COS-7細胞のビタミンD受容体（VDR）、LUCC-LBD-LUCNのルシフェラーゼとリガンド結合ドメイン（LBD）のキメラタンパク質を成功裏に発現しました。LUCC-LBD-LUCNバイオセンサーは、スプリット - ルシフェラーゼビタミンDバイオセンサー（SLDB）と名付けられました。このバイオセンサーは、哺乳類細胞のVDRアゴニストと拮抗薬を検出して識別できます。この研究では、大腸菌（大腸菌）細胞で発現したSLDBタンパク質を使用して、VDRリガンドのin vitroスクリーニングシステムを確立しました。組換え細胞細胞の細胞溶解物を使用したin vitroスクリーニングシステムは、30分以内に完了することができ、その活性は10回の凍結融解サイクルの後に変化しませんでした。この非常に敏感で便利なシステムは、さまざまな骨関連疾患、加齢に関連した認知障害、癌、および免疫障害の治療可能性を備えたVDRリガンドをスクリーニングするのに非常に役立ちます。さらに、私たちのシステムは、25-ヒドロキシビタミンD3および1α、25-ジヒドロキシビタミンD3の血清濃度の診断測定に適用できる場合があります。

Split-luciferase techniques are widely used to detect protein-protein interaction and bioactive small molecules including some hormones and vitamins. Previously, we successfully expressed chimeric proteins of luciferase and the ligand binding domain (LBD) of the vitamin D receptor (VDR), LucC-LBD-LucN in COS-7 cells. The LucC-LBD-LucN biosensor was named split-luciferase vitamin D biosensor (SLDB). This biosensor can detect and discriminate between VDR agonists and antagonists in mammalian cells. In this study, we established an in vitro screening system for VDR ligands using the SLDB proteins expressed in Escherichia coli (E. coli) cells. Our in vitro screening system using cell lysate of recombinant E. coli cells could be completed within 30min, and its activity was unchanged after 10 freeze-thaw cycles. This highly sensitive and convenient system would be quite useful to screen VDR ligands with therapeutic potential for various bone-related diseases, age-related cognitive disorders, cancer, and immune disorders. In addition, our system might be applicable to diagnostic measurement of serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D3 and 1α,25-dihydroxyvitamin D3.