スペルミンを試しましたか？PCRおよびRT-PCRの硫酸ナトリウム阻害を排除するための迅速で費用対効果の高い方法

デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘導大腸炎マウスモデルは、ヒト炎症性腸疾患（IBD）を調査するために一般的に使用されます。これらの動物に由来する核酸抽出物は、しばしばDSSで汚染されます。これは、PCRや逆転写（RT）を含む多くの酵素ベースの分子生物学反応の強力な阻害剤です。核酸からDSSを除去する方法RNAには抽出物が存在しますが、DNAまたはcDNAの効果的なプロトコルは現在利用できません。しかし、スペルミンは以前、ポリヌクレオチドキナーゼのDSS阻害に対抗するための効果的な薬剤であることが示されており、それが仮説につながっており、PCRおよびRTのDSS阻害に対抗するために使用できるというものです。DSS阻害を除去するために、PCRベースのプロトコル（QPCR、2段階RT-QPCR、およびアンプリコンシーケンスライブラリの準備を含む）に適切な濃度でスペルミンを追加する手段を調査しました。最大0.01g/Lの範囲内で、反応効率を大幅に低下させることなく、PCR/QPCRまたはRT予防的にスペルミンを加えることができます。0.08g/Lの濃度でのスペルミンの添加は、最大0.32g/Lの濃度のDSSによって阻害される定性的PCRシグナルを回復するために使用できます。最適な定量分析のために、スペルミンの濃度には細かい調整が必要です。したがって、ここでは、DSSの未知の濃度にさらされた反応の最適な効率を確保するための、スペルミンの濃度を調整するための単純な蛍光ベースの方法を示します。結論として、PCRおよび2段階のRT-QPCRでのDSS阻害に対抗する費用対効果の高い簡単な方法を実証します。分析の定性的または定量的特性に応じて、固定または微調整された濃度のスペルミンを投与できます。

The Dextran Sulfate Sodium (DSS) induced colitis mouse model is commonly used to investigate human inflammatory bowel disease (IBD). Nucleic acid extracts originating from these animals are often contaminated with DSS, which is a strong inhibitor of many enzymatic based molecular biology reactions including PCR and reverse-transcription (RT). Methods for removing DSS from nucleic acids extracts exist for RNA, but no effective protocol for DNA or cDNA is currently available. However, spermine has previously been shown to be an effective agent for counteracting DSS inhibition of polynucleotide kinase, which led to the hypothesis, that spermine could be used to counteract DSS inhibition of PCR and RT. We investigated the means of adding spermine in an adequate concentration to PCR based protocols (including qPCR, two-step RT-qPCR, and amplicon sequencing library preparation) to remove DSS inhibition. Within the range up to 0.01g/L, spermine can be added to PCR/qPCR or RT prophylactically without a significant reduction of reaction efficiency. Addition of spermine at the concentration of 0.08g/L can be used to recover qualitative PCR signal inhibited by DSS in concentrations up to 0.32g/L. For optimal quantitative analysis, the concentration of spermine requires fine adjustment. Hence, we present here a simple fluorometric based method for adjusting the concentration of spermine ensuring an optimal efficiency of the reaction exposed to an unknown concentration of DSS. In conclusion, we demonstrate a cost effective and easy method to counteract DSS inhibition in PCR and two-step RT-qPCR. Fixed or fine-tuned concentrations of spermine can be administered depending on the qualitative or quantitative character of the analysis.