ヒトDroshaの二本鎖RNA結合ドメインへの挿入は、その機能にとって重要です

マイクロRNA（miRNA）は、最初に長い一次転写産物として転写され、次に複数の酵素とタンパク質によって処理され、単一鎖の約22ヌクレオチド（NT）の成熟miRNAを生成します。動物のmiRNA生合成の重要なステップは、酵素Droshaによって前駆体miRNA（プレミルナ）を生成するための一次miRNA転写産物（pri-mirna）の切断です。Droshaがその基質を認識する方法は、不完全に理解されたままです。この研究では、一連のヒトDrosha変異体を構築し、酵素活性とRNAとの相互作用を調べました。N末端領域は、Droshaの核局在と細胞機能に必要であることがわかりました。また、以前の報告とは対照的に、Droshaの二本鎖RNA結合ドメイン（RBD）がRNAに対して弱いが顕著な親和性を示したことを示しました。他のRNA結合タンパク質のRBDと比較して、DroshaのRBDには短い挿入物があり、その変異はRNA結合とPri-MiRNA切断を減少させました。レポーターアッセイにおけるDrosha RBD変異体の過剰発現は、細胞培養におけるDrosha活性の欠陥を裏付けました。さらに、in vitroで、5 'および3' pri-mirnasの5 'および3'鎖の切断に異なる影響を受けたウィルムス腫瘍に関与するDroshaのrnaseiiibドメインの点変異がin vitroで発見されました。結論として、我々の結果は、ヒトDroshaによるPri-Mirna処理のメカニズムに関する重要な洞察を提供しました。

microRNAs (miRNAs) are first transcribed as long, primary transcripts, which are then processed by multiple enzymes and proteins to generate the single-stranded, approximately 22-nucleotide (nt)-long mature miRNAs. A critical step in animal miRNA biogenesis is the cleavage of primary miRNA transcripts (pri-miRNAs) to produce precursor miRNAs (pre-miRNAs) by the enzyme Drosha. How Drosha recognizes its substrates remains incompletely understood. In this study we constructed a series of human Drosha mutants and examined their enzymatic activities and interaction with RNAs. We found that the N-terminal region is required for the nuclear localization and cellular function of Drosha. And in contrast to previous reports, we showed that the double-stranded RNA binding domain (RBD) of Drosha exhibited a weak but noticeable affinity for RNA. Compared to the RBDs of other RNA-binding proteins, the RBD of Drosha has a short insert, whose mutations reduced RNA binding and pri-miRNA cleavage. Overexpression of Drosha RBD mutants in a reporter assay corroborated their deficiencies in Drosha activity in cell cultures. In addition, we found that point mutations in the RNaseIIIb domain of Drosha implicated in Wilms tumors differentially affected cleavage of the 5' and 3' strands of pri-miRNAs in vitro. In conclusion, our results provided important insights into the mechanism of pri-miRNA processing by human Drosha.