ネストされたPUFタンパク質：遺伝子調節の標的RNA要素を拡張する

大型トランスクリプトーム内のユニークな配列を認識するRNA結合タンパク質は、RNA代謝を制御するための強力なツールとして機能します。PumilioおよびFem-3 mRNA結合因子（PUF）タンパク質は、通常、8つの非常に相同性の反復セグメントで構成されており、任意の8 NT RNA配列を認識するように設計できるため、このようなツールの良い候補と見なされます。ただし、特定の8 NT RNA配列は、トランスクリプトームのさまざまなRNAの複数の部位で見つかり、単一のRNAを標的にすることは困難です。より長いRNA配列を認識する設計者PUFタンパク質は、より選択的な結合を達成するはずです。ここでは、トランスクリプトームに単一のユニークなmRNAを標的とすることができる16回の繰り返しPUFを作成するためのアプローチを提案します。私たちのデザインはシンプルで、2つのPUFセグメントのタンデムアラインメントまたは別のPUFセグメントのネストが含まれます。元の8リピートPUFに由来する部分的な認識なしに、ターゲットRNA配列に結合した16リピートPUFを設計しました。さらに、我々の戦略に基づいて、内因性mRNAの発現は選択的かつ効果的に調節され、内因性RNA代謝を調節するための16反復PUFタンパク質の適用可能性を実証しました。

RNA-binding proteins recognizing unique sequences within large transcriptomes serve as a powerful tool to control RNA metabolism. Pumilio and fem-3 mRNA-binding factor (PUF) proteins are considered good candidates for such tools, because they are typically composed of eight highly homologous repeat segments and can be designed to recognize arbitrary 8 nt RNA sequences. However, a specific 8 nt RNA sequence is found at multiple sites in various RNAs in the transcriptome, making it difficult to specifically target a single RNA. Designer PUF proteins recognizing longer RNA sequences should achieve more selective binding. Here, we propose an approach for creating 16-repeat PUFs capable of targeting a single, unique mRNA in the transcriptome. Our design is simple and involves either the tandem alignment of two PUF segments or the nesting of one PUF segment within another. Designed 16-repeat PUFs bound to the target RNA sequence without partial recognition derived from the original 8-repeat PUF. Furthermore, based on our strategy, expression of an endogenous mRNA was selectively and effectively modulated, demonstrating the applicability of 16-repeat PUF proteins for regulating endogenous RNA metabolism.