VH/VLレパートリーの次世代DNAシーケンス：単一ドメイン抗体発見における用途のプライマーとガイド

発現した抗体レパートリーの免疫遺伝学的分析は、ますます一般的な実験的調査になりつつあり、自己免疫、感染症、および癌の理解を促進するために重要です。次世代DNAシーケンス（NGS）技術により、通常、免疫グロブリン変数ドメインをコードするcDNAのシーケンスにより、抗体レパートリーを前例のない深さに尋問することが可能になりました。この章では、イルミナMISEQプラットフォームを使用して、再配置された免疫グロブリン重および軽鎖遺伝子の可変領域（VH、VHHまたはVL）に由来するマルチプレックスPCRアンプリコンを生成および配列決定するためのシンプルで高速で信頼できる方法について説明します。VH/VHH/VLレパートリーのアンプリコンシーケンス用の完全なプロトコルとプライマーセットを、ヒト、マウス、およびラマリンパ球から直接、およびファージ変形したVH/VHH/VLライブラリから含めます。これらは、変更がほとんどなく、他のタイプのアンプリコンに簡単に適応できます。結果として得られるアンプリコンは多様で代表的であり、わずか103の入力Bセルを使用していても、それらの世代は比較的安価であり、特別な機器と限られたプライマーのセットのみを必要とします。重灯鎖のペアリングがない場合、単一ドメイン抗体はNGS分析に独自に適格です。以下を含む、ファージディスプレイライブラリからの単一ドメイン抗体の発見に役立つNGSテクノロジーの多くのアプリケーションを提示します。（i）ライブラリ機能の評価。（ii）望ましいライブラリランダム化の確認。（iii）図書館の多様性の推定。（iv）実験のパンの進捗状況の監視。ここで提示されているケーススタディは、ファージが表示された単一ドメイン抗体ライブラリのものですが、原則は他のタイプのin vitroディスプレイライブラリに拡張されています。

Immunogenetic analyses of expressed antibody repertoires are becoming increasingly common experimental investigations and are critical to furthering our understanding of autoimmunity, infectious disease, and cancer. Next-generation DNA sequencing (NGS) technologies have now made it possible to interrogate antibody repertoires to unprecedented depths, typically by sequencing of cDNAs encoding immunoglobulin variable domains. In this chapter, we describe simple, fast, and reliable methods for producing and sequencing multiplex PCR amplicons derived from the variable regions (VH, VHH or VL) of rearranged immunoglobulin heavy and light chain genes using the Illumina MiSeq platform. We include complete protocols and primer sets for amplicon sequencing of VH/VHH/VL repertoires directly from human, mouse, and llama lymphocytes as well as from phage-displayed VH/VHH/VL libraries; these can be easily be adapted to other types of amplicons with little modification. The resulting amplicons are diverse and representative, even using as few as 103 input B cells, and their generation is relatively inexpensive, requiring no special equipment and only a limited set of primers. In the absence of heavy-light chain pairing, single-domain antibodies are uniquely amenable to NGS analyses. We present a number of applications of NGS technology useful in discovery of single-domain antibodies from phage display libraries, including: (i) assessment of library functionality; (ii) confirmation of desired library randomization; (iii) estimation of library diversity; and (iv) monitoring the progress of panning experiments. While the case studies presented here are of phage-displayed single-domain antibody libraries, the principles extend to other types of in vitro display libraries.