シングルディジェストとダブルディゲストのRAD-SEQライブラリのバイアスの実質的な違い：ケーススタディ

シングルダイジェストと二重層制限部位関連DNAシーケンス（RAD-seq）プロトコルを使用するトレードオフが広く議論されています。ただし、2つの方法の直接的な経験的比較は実施されていません。ここでは、湾岸ピペフィッシュ（Syngnathus scovelli）の単一集団をサンプリングし、Rad-seqを使用して444人の個人を遺伝子型としました。60人がシングルディゲストRAD-seq（SDRAD-seq）を受け、残りの384人は二重消化RAD-Seq（DDRAD-seq）プロトコルを使用して遺伝子型にされました。結果のイルミナシーケンスデータを分析し、読み取りが一緒にまたは別々に分析されたときに2つのジェノタイピング方法を比較しました。カバレッジ統計、観察されたヘテロ接合性、および対立遺伝子頻度は、選択コンポーネント分析の結果と同様に、2つのプロトコル間で大幅に異なりました。また、湾岸のピペフィッシュゲノムのシリコ消化を行い、PCRの重複、多型制限部位、せん断バイアス、非対称サンプリング（すなわち、SDRAD-SEQを持つ個人がDDRAD-SEQよりもSDRAD-SEQよりも少ない）などの5つの主要なバイアス源をモデル化しました。主要な対立遺伝子頻度。このアプローチの組み合わせにより、多型制限部位、非対称サンプリングスキーム、平均対立遺伝子頻度、およびある程度PCRの複製がすべて、SDRAD-seq対ddrad-seqを使用して遺伝子型のアレル頻度の異なる推定値に寄与することを判断することができました。SDRAD-seqとddrad-seqが異なる対立遺伝子頻度をもたらす可能性があるという我々の発見は、自然集団における進化プロセスのゲノムワイドな署名を特定するために努力する研究と技術間の比較に影響を与えます。

The trade-offs of using single-digest vs. double-digest restriction site-associated DNA sequencing (RAD-seq) protocols have been widely discussed. However, no direct empirical comparisons of the two methods have been conducted. Here, we sampled a single population of Gulf pipefish (Syngnathus scovelli) and genotyped 444 individuals using RAD-seq. Sixty individuals were subjected to single-digest RAD-seq (sdRAD-seq), and the remaining 384 individuals were genotyped using a double-digest RAD-seq (ddRAD-seq) protocol. We analysed the resulting Illumina sequencing data and compared the two genotyping methods when reads were analysed either together or separately. Coverage statistics, observed heterozygosity, and allele frequencies differed significantly between the two protocols, as did the results of selection components analysis. We also performed an in silico digestion of the Gulf pipefish genome and modelled five major sources of bias: PCR duplicates, polymorphic restriction sites, shearing bias, asymmetric sampling (i.e., genotyping fewer individuals with sdRAD-seq than with ddRAD-seq) and higher major allele frequencies. This combination of approaches allowed us to determine that polymorphic restriction sites, an asymmetric sampling scheme, mean allele frequencies and to some extent PCR duplicates all contribute to different estimates of allele frequencies between samples genotyped using sdRAD-seq versus ddRAD-seq. Our finding that sdRAD-seq and ddRAD-seq can result in different allele frequencies has implications for comparisons across studies and techniques that endeavour to identify genomewide signatures of evolutionary processes in natural populations.