競合結合技術を使用した機能的アッセイにおけるリガンドの薬理学的特性を決定するには、標準曲線が必要です

競争結合技術を利用する均一な機能アッセイは、固有の活動や効力などの薬理学的特性を決定するために広く使用されています。1つの例は、時間分解された蛍光共鳴エネルギー移動（TR-FRET）3 '、5'-環状アデノシンモノリン酸（cAMP）アッセイで、標識cAMP（トレーサー）と標識抗キャンプ抗体が結合してTR-fretを生成することです。2つの構成要素が互いに近位にある場合の信号。このシグナルは、標識抗体に結合するためにTracer CAMPと細胞生成されたcAMPがTRACER CAMPと競合すると、標識抗体への結合の場合に破壊されます。通常、TR-FRET比として表される結果のアッセイ信号を、cAMP標準曲線を使用してキャンプ濃度に変換することが重要です。ただし、研究者がリガンドの固有の活動と効力の値を決定するためにレシオメトリック信号（標準曲線を使用して変換されていない）を使用している文献では、例がまだ生成されています。変換されていない生データは、しばしば合理的に見えるシグモイド濃度応答曲線を生成し、おそらく、薬理学的モデルを適用するために変換されたデータの代わりに生データを使用するよう調査員を誘惑するでしょう。この記事では、GLP-1（7-36）を介したTR-FRET CAMPの蓄積とシミュレートされたデータのライセート希釈アッセイを使用してcAMPレベルの変化をもたらすリガンドの効力と固有の活性を決定するための正しい手順について説明します。また、生の信号データの不適切な使用が、リガンドの固有の活動と効力の解釈に劇的に影響を与えること、そしてこれが薬物発見プログラムにどのように悪影響を与えるかを強調しています。これらの発見は、cAMP機能アッセイだけでなく、競合結合技術を利用する他の機能的細胞シグナル伝達アッセイにも適用されます。

Homogeneous functional assays that utilize competition binding technology are widely used for determining pharmacological properties such as intrinsic activity and potency. One example is time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) 3',5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) assays, where labeled cAMP (tracer) and a labeled anti-cAMP antibody bind together to produce a TR-FRET signal when the two constituents are proximal to each other. This signal is disrupted when unlabeled and cellularly generated cAMP competes with the tracer cAMP for binding to the labeled antibody. It is important that the resulting assay signal, usually expressed as a TR-FRET ratio, be transformed to cAMP concentration using a cAMP standard curve. However, examples are still generated in the literature wherein investigators have used the ratiometric signal (not transformed using a standard curve) to determine values for intrinsic activity and potency of ligands. Untransformed raw data often produce reasonable looking sigmoidal concentration response curves, perhaps tempting investigators to use the raw data instead of the transformed data for applying pharmacological models. In this article, we describe the correct procedure for determining the potency and intrinsic activity of ligands that result in changes in cAMP levels using a lysate dilution assay of GLP-1 (7-36)-mediated TR-FRET cAMP accumulation and simulated data. We also highlight how the inappropriate use of raw signal data can dramatically affect interpretation of intrinsic activity and potency of ligands, and how this can adversely affect drug discovery programs. These findings apply not only to cAMP functional assays but also to other functional cellular signaling assays that utilize competition binding technologies.