人間の肺内皮細胞バリア機能に対する同族、非共同および合成CXCR4およびACKR3リガンドの影響

最近の証拠は、ケモカイン受容体CXCR4およびACKR3の同種アゴニストであるケモカインCXCL12が、内皮バリア機能のトロンビン媒介障害を減らすことを示唆しています。トロンビンを介したヒト肺内皮高速性に対するCXCL12の効果の詳細な特性評価は不足しており、構造機能相関は利用できません。さらに、肺内皮バリア機能に対する他のCXCR4/ACKR3リガンドの効果は不明です。したがって、CXCR4/ACKR3リガンドのパネル（CXCL12、CXCL11、ユビキチン、AMD3100、TC14012）の効果をテストし、CXCL12バリエーションのCXCR4/ACKR3活性（CXCL12α/β、CXCL12121（CXCL121）、CXCL121、CXCL12121（CXCL12α/β）、、CXCL12-S-S4V、CXCL12-R47E、CXCL12-K27A/R41A/R47A）透過性アッセイにおけるヒト肺内皮バリア機能への影響を伴う。CXCL12αは、ヒト原発性肺動脈内皮細胞（HPPAEC）のバリア機能を促進しましたが、CXCL11、ユビキチン、AMD3100およびTC14012は効果がありませんでした。HPPAECのCXCL12αおよびユビキチンによる前処理は、トロンビンを介した高速性を減少させました。トロンビン曝露後のHPPAECのCXCL12α治療は、障壁機能障害を70％（EC50 0.05-0.5NM）減少させ、AMD3100に拮抗する可能性があります。ユビキチン（0.03-3μm）は効果がありませんでした。ヒト肺微小血管内皮細胞株（HULEC5A）では、CXCL12αおよびユビキチン後治療後の治療後、トロンビン誘発性過容能が同様の程度まで減衰しました。CXCL12（3-68）は、Presto-Tangoβ-Arrestin2リクルートメントアッセイのCXCR4を活性化するのに非効率的でした。CXCL12-S-S4V、CXCL12-R47EおよびCXCL12-K27A/R41A/R47Aは、CXCR4を活性化するために有意に減少する権限を示しました。ACKR3 Presto-Tangoアッセイのすべてのタンパク質の効力は同等でしたが、ACKR3を活性化するCXCL12（3-68）の有効性は大幅に減少しました。トロンビンを介したHPPAECバリア機能障害を減衰させる能力は、CXCL12α/β、CXCL121、CXCL12-K27A/R41A/R47A> CXCL12-S-S4V、CXCL12-R47E> CXCL122> CXCL12（3-68）でした（3-68）。我々の発見は、CXCR4の活性化がトロンビン誘発肺内皮バリア機能障害を減衰させ、CXCL12の保護効果がCXCR4アゴニスト活性と内皮表面上のヘパラン硫酸塩との異なるタンパク質部分の相互作用によって決定されることを示唆していることを示しています。これらのデータは、肺循環におけるトロンビン誘発血管漏出を減衰させるために、薬理学的特性を改善した化合物の発達を促進する可能性があります。

Recent evidence suggests that chemokine CXCL12, the cognate agonist of chemokine receptors CXCR4 and ACKR3, reduces thrombin-mediated impairment of endothelial barrier function. A detailed characterization of the effects of CXCL12 on thrombin-mediated human lung endothelial hyperpermeability is lacking and structure-function correlations are not available. Furthermore, effects of other CXCR4/ACKR3 ligands on lung endothelial barrier function are unknown. Thus, we tested the effects of a panel of CXCR4/ACKR3 ligands (CXCL12, CXCL11, ubiquitin, AMD3100, TC14012) and compared the CXCR4/ACKR3 activities of CXCL12 variants (CXCL12α/β, CXCL12(3-68), CXCL121, CXCL122, CXCL12-S-S4V, CXCL12-R47E, CXCL12-K27A/R41A/R47A) with their effects on human lung endothelial barrier function in permeability assays. CXCL12α enhanced human primary pulmonary artery endothelial cell (hPPAEC) barrier function, whereas CXCL11, ubiquitin, AMD3100 and TC14012 were ineffective. Pre-treatment of hPPAEC with CXCL12α and ubiquitin reduced thrombin-mediated hyperpermeability. CXCL12α-treatment of hPPAEC after thrombin exposure reduced barrier function impairment by 70% (EC50 0.05-0.5nM), which could be antagonized with AMD3100; ubiquitin (0.03-3μM) was ineffective. In a human lung microvascular endothelial cell line (HULEC5a), CXCL12α and ubiquitin post-treatment attenuated thrombin-induced hyperpermeability to a similar degree. CXCL12(3-68) was inefficient to activate CXCR4 in Presto-Tango β-arrestin2 recruitment assays; CXCL12-S-S4V, CXCL12-R47E and CXCL12-K27A/R41A/R47A showed significantly reduced potencies to activate CXCR4. While the potencies of all proteins in ACKR3 Presto-Tango assays were comparable, the efficacy of CXCL12(3-68) to activate ACKR3 was significantly reduced. The potencies to attenuate thrombin-mediated hPPAEC barrier function impairment were: CXCL12α/β, CXCL121, CXCL12-K27A/R41A/R47A > CXCL12-S-S4V, CXCL12-R47E > CXCL122 > CXCL12(3-68). Our findings indicate that CXCR4 activation attenuates thrombin-induced lung endothelial barrier function impairment and suggest that protective effects of CXCL12 are dictated by its CXCR4 agonist activity and interactions of distinct protein moieties with heparan sulfate on the endothelial surface. These data may facilitate development of compounds with improved pharmacological properties to attenuate thrombin-induced vascular leakage in the pulmonary circulation.