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背景:B細胞悪性腫瘍患者のin vivo有効性を約束しているにもかかわらず、効力と免疫毒性Ex in vivoに関連するCD19を標的とするキメラ抗原受容体(CAR)の機能的属性を特徴付けることは困難なままです。 方法:抗原特異的刺激時にCD19 CAR-T細胞の機能プロファイルを評価するために、シングルセル、16-plexサイトカインマイクロ流体デバイスと新しい分析技術を採用しました。CAR-T細胞は、CD19-BB-Z導入遺伝子をコードするレンチウイルスをトランスフェクトしたヒトPBMCから製造し、抗CD3/抗CD28コーティングビーズで拡張しました。濃縮CAR-T細胞を抗カーまたはコントロールIgGビーズで刺激し、抗CD4 RPEおよび抗CD8 Alexa Fluor 647抗体で染色し、単一細胞バーコードチップ(SCBC)で16時間インキュベートしました。各SCBCには、16枚のプレックス抗体アレイの完全なコピーで事前にパターンされたガラススライドで覆われた約12,000のマイクロチャンバーが含まれています。単一のCAR-T細胞からのタンパク質分泌をキャプチャし、その後、独自のソフトウェアと新しい視覚化方法を使用して分析しました。 結果:4人の健康なドナーから調製されたCD19 CAR-T前灌流製品のシングルセルプロファイリングの新しい方法を示します。Car-T単一細胞は、細胞質分泌の顕著な不均一性と、抗炭化ビーズ刺激に特有の多機能(2+サイトカイン)サブセットを示しました。応答の幅には、抗腫瘍エフェクター(グランザイムB、IFN-γ、MIP-1α、TNF-α)、刺激性(GM-CSF、IL-2、IL-8)、調節(IL-4、IL-13が含まれます。、IL-22)、および炎症性(IL-6、IL-17A)機能。さらに、より効果的な多機能サブセットの視覚化とドナー間の比較のために、2つの新しいバイオインフォマティクスツールを開発しました。 結論:CD19 CAR-T製品のシングルセル、多重化されたプロテオームプロファイリングは、CD19 CAR-T細胞の抗原特異的課題に対する免疫エフェクター応答の多様な景観を明らかにし、相関分析のためのCAR-T製品データをキャプチャするための新しいプラットフォームを提供する。さらに、このような高次元データには、これらの製品の正確な多機能応答の違いをさらに定義するために、新しい視覚化方法が必要です。提示されたバイオマーカーキャプチャおよび分析システムは、CAR-T前灌流製品のより敏感で包括的な機能評価を提供し、CAR-T細胞療法の安全性と有効性に関する洞察を提供する可能性があります。
背景:B細胞悪性腫瘍患者のin vivo有効性を約束しているにもかかわらず、効力と免疫毒性Ex in vivoに関連するCD19を標的とするキメラ抗原受容体(CAR)の機能的属性を特徴付けることは困難なままです。 方法:抗原特異的刺激時にCD19 CAR-T細胞の機能プロファイルを評価するために、シングルセル、16-plexサイトカインマイクロ流体デバイスと新しい分析技術を採用しました。CAR-T細胞は、CD19-BB-Z導入遺伝子をコードするレンチウイルスをトランスフェクトしたヒトPBMCから製造し、抗CD3/抗CD28コーティングビーズで拡張しました。濃縮CAR-T細胞を抗カーまたはコントロールIgGビーズで刺激し、抗CD4 RPEおよび抗CD8 Alexa Fluor 647抗体で染色し、単一細胞バーコードチップ(SCBC)で16時間インキュベートしました。各SCBCには、16枚のプレックス抗体アレイの完全なコピーで事前にパターンされたガラススライドで覆われた約12,000のマイクロチャンバーが含まれています。単一のCAR-T細胞からのタンパク質分泌をキャプチャし、その後、独自のソフトウェアと新しい視覚化方法を使用して分析しました。 結果:4人の健康なドナーから調製されたCD19 CAR-T前灌流製品のシングルセルプロファイリングの新しい方法を示します。Car-T単一細胞は、細胞質分泌の顕著な不均一性と、抗炭化ビーズ刺激に特有の多機能(2+サイトカイン)サブセットを示しました。応答の幅には、抗腫瘍エフェクター(グランザイムB、IFN-γ、MIP-1α、TNF-α)、刺激性(GM-CSF、IL-2、IL-8)、調節(IL-4、IL-13が含まれます。、IL-22)、および炎症性(IL-6、IL-17A)機能。さらに、より効果的な多機能サブセットの視覚化とドナー間の比較のために、2つの新しいバイオインフォマティクスツールを開発しました。 結論:CD19 CAR-T製品のシングルセル、多重化されたプロテオームプロファイリングは、CD19 CAR-T細胞の抗原特異的課題に対する免疫エフェクター応答の多様な景観を明らかにし、相関分析のためのCAR-T製品データをキャプチャするための新しいプラットフォームを提供する。さらに、このような高次元データには、これらの製品の正確な多機能応答の違いをさらに定義するために、新しい視覚化方法が必要です。提示されたバイオマーカーキャプチャおよび分析システムは、CAR-T前灌流製品のより敏感で包括的な機能評価を提供し、CAR-T細胞療法の安全性と有効性に関する洞察を提供する可能性があります。
BACKGROUND: It remains challenging to characterize the functional attributes of chimeric antigen receptor (CAR)-engineered T cell product targeting CD19 related to potency and immunotoxicity ex vivo, despite promising in vivo efficacy in patients with B cell malignancies. METHODS: We employed a single-cell, 16-plex cytokine microfluidics device and new analysis techniques to evaluate the functional profile of CD19 CAR-T cells upon antigen-specific stimulation. CAR-T cells were manufactured from human PBMCs transfected with the lentivirus encoding the CD19-BB-z transgene and expanded with anti-CD3/anti-CD28 coated beads. The enriched CAR-T cells were stimulated with anti-CAR or control IgG beads, stained with anti-CD4 RPE and anti-CD8 Alexa Fluor 647 antibodies, and incubated for 16 h in a single-cell barcode chip (SCBC). Each SCBC contains ~12,000 microchambers, covered with a glass slide that was pre-patterned with a complete copy of a 16-plex antibody array. Protein secretions from single CAR-T cells were captured and subsequently analyzed using proprietary software and new visualization methods. RESULTS: We demonstrate a new method for single-cell profiling of CD19 CAR-T pre-infusion products prepared from 4 healthy donors. CAR-T single cells exhibited a marked heterogeneity of cytokine secretions and polyfunctional (2+ cytokine) subsets specific to anti-CAR bead stimulation. The breadth of responses includes anti-tumor effector (Granzyme B, IFN-γ, MIP-1α, TNF-α), stimulatory (GM-CSF, IL-2, IL-8), regulatory (IL-4, IL-13, IL-22), and inflammatory (IL-6, IL-17A) functions. Furthermore, we developed two new bioinformatics tools for more effective polyfunctional subset visualization and comparison between donors. CONCLUSIONS: Single-cell, multiplexed, proteomic profiling of CD19 CAR-T product reveals a diverse landscape of immune effector response of CD19 CAR-T cells to antigen-specific challenge, providing a new platform for capturing CAR-T product data for correlative analysis. Additionally, such high dimensional data requires new visualization methods to further define precise polyfunctional response differences in these products. The presented biomarker capture and analysis system provides a more sensitive and comprehensive functional assessment of CAR-T pre-infusion products and may provide insights into the safety and efficacy of CAR-T cell therapy.
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