その後のフローサイトメトリック分析のために、単一細胞への単一および共培養スフェロイドの解離

背景：スフェロイドは、2D細胞培養よりも優れた細胞の自然な組織を反映すると考えられていますが、フローサイトメトリーによる分析には単一の細胞への解離が必要です。 方法：ヒト線維芽細胞とヒト内皮細胞で構成される単一および共培養スフェロイドの解離のためのプロトコルを確立しました。解離後の細胞回収率と生存率は、血球計およびフローサイトメトリーで評価されました。細胞の直径と細胞凝集体の量はCasy®テクノロジーによって定量化され、細胞組成はフローサイトメトリーによって分析されました。 結果：低細胞凝集による最適な解離条件は、スフェロイドのサイズ、栽培時間、細胞組成によって決定されました。より小さなスフェロイド（10,000細胞）はAccutase®で解離することができますが、より大きなスフェロイド（50,000細胞）はより厳しい解離条件を必要としました。細胞のサイズは、栽培時間の増加とともに減少しました。細胞の回収率は、細胞組成とスフェロイドサイズに依存していました。共培養スフェロイドについては、最高の細胞回収率が見つかりました。分離した線維芽細胞スフェロイドについては、最高の細胞生存率が検出されました。解離した共培養スフェロイドの細胞組成の定量分析が可能でした。 議論：スフェロイドは、その後のフローサイトメトリック分析のために、特異細胞に正常に解離することができます。解離条件、細胞回収率と細胞生存率は、スフェロイドのサイズ、栽培時間、細胞組成に依存します。スフェロイドの細胞サイズが長期にわたって観察された減少は、スフェロイドサイズのよく知られている時間依存の減少の原因である可能性があります。

BACKGROUND: Spheroids are considered to reflect the natural organization of cells better than 2D cell cultures, but their analysis by flow cytometry requires dissociation into single cells. METHODS: We established protocols for dissociation of mono- and co-culture spheroids consisting of human fibroblasts and human endothelial cells. Cell recovery rate and viability after dissociation were evaluated with hemocytometer and by flow cytometry. The diameter of cells and the amount of cell aggregates were quantified by Casy®-technology and the cellular composition was analyzed by flow cytometry. RESULTS: Optimal dissociation conditions with low cell aggregation were determined by size, cultivation time and cellular composition of the spheroids. Smaller spheroids (10,000 cells) could be dissociated with Accutase®, whereas larger spheroids (50,000 cells) required more stringent dissociation conditions. The size of the cells decreased with increasing cultivation time. Cell recovery rate was dependent upon cellular composition and spheroid size. The highest cell recovery rate was found for co-culture spheroids. The highest cell viability was detected for dissociated fibroblast spheroids. A quantitative analysis of the cellular composition of dissociated co-culture spheroids was possible. DISCUSSION: Spheroids can be successfully dissociated into singular cells for subsequent flow cytometric analysis. Dissociation conditions as well as cell recovery rate and cell viability depend on size, cultivation time and cellular composition of the spheroids. The observed decrease in cell size in spheroids over time might be responsible for the well-known time-dependent decrease in spheroid size.