血小板因子4の高収量発現と精製システムの開発

ヘパリン誘発性血小板減少症（HIT）は、血小板因子4（PF4）およびヘパリンの複合体に結合したIgG抗体を特徴とする有害な薬物反応です。HITの診断テストの大部分は、PF4の外因性源に依存して抗PF4/ヘパリン抗体を特定しています。これらには、とりわけPF4依存性強化されたセロトニン放出アッセイ（PF4-SRA）が含まれます。細菌発現システムを使用して、血小板由来のヒトPF4と生化学的および抗原的に類似した組換えヒトPF4（RHPF4）を生成する新規で効率的な方法を開発しました。Rhpf4は、大腸菌のBL21（DE3）株のPET発現システムを使用して生成されました。このシステムは、異なる誘導温度とインキュベーション時間でイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを使用したタンパク質発現のために最適化されました。RHPF4の溶解度は、細胞溶解中に異なる洗剤を使用し、ヘパリン親和性およびイオン交換クロマトグラフィーで精製することにより改善されました。rhPF4の生化学的特性は、質量分析、SDS-PAGE分析、およびゲルろ過クロマトグラフィーを使用して、血小板由来のPF4と比較して調査されました。Rhpf4の抗原および機能的特性は、抗PF4/ヘパリンEIAおよびPF4-SRAを使用して研究されました。この方法を使用して、細菌培養1リットルあたり11.4±0.6 mgの純粋なRhpf4を生成できます。血小板由来およびrhPF4を使用した抗PF4/ヘパリンEIAからの吸光度の読み取り値は高度に相関していました（n = 194; r = 0.9545、p <0.0001）。抗PF4/ヘパリン抗体によって誘導されるPF4-SRAにおけるセロトニンの機能放出は、血小板由来またはrhPF4およびヘパリンのいずれかに類似していた（r = 0.9597、p <0.0001）。RHPF4生産の方法は効率的であり、血小板の供給源に依存していません。記載されているRHPF4精製法は、他の現在の方法よりも低コストでより大きな収量を生成します。この方法を適用すると、生化学的調査の効率を改善し、十分な量のPF4を供給することにより診断テストにヒットできます。

Heparin-induced thrombocytopenia (HIT) is an adverse drug reaction characterized by IgG antibodies bound to complexes of platelet factor 4 (PF4) and heparin. The majority of diagnostic tests for HIT rely on an exogenous source of PF4 to identify anti-PF4/heparin antibodies. These include the PF4-dependent enhanced serotonin release assay (PF4-SRA) among others. Using a bacterial expression system, we developed a novel and efficient method of producing recombinant human PF4 (rhPF4) that is biochemically and antigenically similar to platelet-derived human PF4. rhPF4 was produced using the pET expression system in the BL21(DE3) strain of Escherichia coli. The system was optimized for protein expression using isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside at different induction temperatures and incubation times. rhPF4 solubility was improved by using different detergents during cell lysis and by purifying with heparin affinity and ion exchange chromatography. Biochemical characteristics of rhPF4 were investigated using mass spectrometry, SDS-PAGE analysis, and gel filtration chromatography and compared to platelet-derived PF4. Antigenic and functional characteristics of rhPF4 were studied using the anti-PF4/heparin EIA and the PF4-SRA. Using this method, we could produce 11.4 ± 0.6 mg of pure rhPF4 per liter of bacterial culture. Absorbance readings from the anti-PF4/heparin EIA using platelet-derived and rhPF4 were highly correlated (n = 194; r = 0.9545, p < 0.0001); and functional release of serotonin in the PF4-SRA induced by anti-PF4/heparin antibodies was similar to either platelet-derived or rhPF4 and heparin (r = 0.9597, p < 0.0001). Our method of rhPF4 production is efficient and does not rely on a source of platelets. The rhPF4 purification method described produces greater yields at a lower cost than other current methods. The application of this method can improve the efficiency of biochemical investigations and HIT diagnostic testing by supplying sufficient amounts of PF4.