安定性の向上と効率的なCRISPR-CAS9遺伝子編集のための合成ガイドRNAの最小2'-O-メチルホスホロチオエート結合修飾パターン細胞毒性の回避

哺乳類細胞での最初の応用以来、CRISPR-CAS9は、ゲノム工学実験の好ましい方法に急速になりました。CAS9ヌクレアーゼは、DNAターゲットCRISPR RNA（CRRNA）とトランス活性化CRRNA（tracRRNA）、またはキメラシングルガイドRNAとして構成されるネイティブデュアルRNAシステムとして、ガイドRNA（GRNA）を使用したゲノムDNAを標的としています。（sgrna）。Cas9タンパク質またはCas9 mRNAおよび化学合成GRNAのいずれかを使用した完全にDNAフリーのCRISPR-CAS9システムにより、CRISPR-CAS9成分の一時的な発現が可能になり、治療用途での重要な利点があります。さらに、合成GRNAを使用すると、安定性の向上を含む強化された特性に化学修飾を組み込むことができます。以前の研究では、化学的に修飾されたGRNAの有用性が実証されていましたが、Cas9 mRNAとの共電力化における複数の修飾を伴う1つのパターンまたはCas9プラスミド脂質共トランスフェクションを使用した複数の修飾とパターンに焦点を当てています。ここでは、一連の化学修飾合成SGRNA分子と化学修飾CRRNA：エレクトロポレーションと脂質トランスフェクションの両方で化学的に修飾されたCRRNAを使用して、インデル形成および/または表現型遺伝子ノックアウトを評価する遺伝子編集結果を提示します。Cas9 mRNAとの共電気療法には修飾が必要であるが、GRNAのいくつかの修飾パターンは未修飾GRNAと比較して細胞に毒性があり、ほとんどの修飾パターンは遺伝子編集効率を大幅に改善しないことを示しています。また、Cas9 mRNAまたはCas9タンパク質を併用した場合にCas9遺伝子編集効率を適度に改善できるGRNAの修飾パターンを提示します（> 1.5倍の差）。これらの結果は、一次細胞に関連するものを含む特定のアプリケーションでは、合成CRRNAのすべての化学修飾パターン：tracRRNAまたはSGRNAがCRISPR-CAS9遺伝子編集に有益である可能性があることを示しています。

Since its initial application in mammalian cells, CRISPR-Cas9 has rapidly become a preferred method for genome engineering experiments. The Cas9 nuclease is targeted to genomic DNA using guide RNAs (gRNA), either as the native dual RNA system consisting of a DNA-targeting CRISPR RNA (crRNA) and a trans-activating crRNA (tracrRNA), or as a chimeric single guide RNA (sgRNA). Entirely DNA-free CRISPR-Cas9 systems using either Cas9 protein or Cas9 mRNA and chemically synthesized gRNAs allow for transient expression of CRISPR-Cas9 components, thereby reducing the potential for off-targeting, which is a significant advantage in therapeutic applications. In addition, the use of synthetic gRNA allows for the incorporation of chemical modifications for enhanced properties including improved stability. Previous studies have demonstrated the utility of chemically modified gRNAs, but have focused on one pattern with multiple modifications in co-electroporation with Cas9 mRNA or multiple modifications and patterns with Cas9 plasmid lipid co-transfections. Here we present gene editing results using a series of chemically modified synthetic sgRNA molecules and chemically modified crRNA:tracrRNA molecules in both electroporation and lipid transfection assessing indel formation and/or phenotypic gene knockout. We show that while modifications are required for co-electroporation with Cas9 mRNA, some modification patterns of the gRNA are toxic to cells compared to the unmodified gRNA and most modification patterns do not significantly improve gene editing efficiency. We also present modification patterns of the gRNA that can modestly improve Cas9 gene editing efficiency when co-transfected with Cas9 mRNA or Cas9 protein (> 1.5-fold difference). These results indicate that for certain applications, including those relevant to primary cells, the incorporation of some, but not all chemical modification patterns on synthetic crRNA:tracrRNA or sgRNA can be beneficial to CRISPR-Cas9 gene editing.