ヒト胆汁酸輸送体ASBT（SLC10A2）は、機能的な非共有ホモダイマーと高次オリゴマーを形成します

ヒト頂端のナトリウム依存性胆汁酸輸送体であるHASBT/SLC10A2は、遠位回腸からの胆汁酸の効率的な再吸収を介して、コレステロール恒常性において中心的な役割を果たします。HASBTは高次の複合体で自己関連することが示されていますが、内因性システインの機能的役割が報告されていますが、HASBTのオリゴマー化への影響は未解決のままです。ここでは、生化学的、免疫学的、および機能的アプローチと組み合わせた部位指向的な突然変異誘発により、HASBTの自己協会アーキテクチャを決定しました。段階的に13の内因性システインすべてに点変異を作成することにより、システインのないHASBTの形態を生成しました。CySless HasBTは、表面発現の低下と相関する機能を大幅に減少させましたが、免疫ブロットのWT-HASBTからの分化を促進する追加のグリコシル化部位を特徴としていました。タンパク質発現の減少は、CySless HasBTタンパク質の不安定性とその後のプロテアソーム依存性分解と関連していました。野生型およびCysless種の化学架橋により、HASBTは、内因性システイン残基を明らかに必要としない活性二量体および/または高次のオリゴマーとして存在することが明らかになりました。これは、差次的にタグ付けされた（ha-、flag-）野生型およびcysless hasBTの共免疫沈降によってさらに裏付けられました。最後に、CySless HASBTは、機能レベルでのヘテロ二量体化/オリゴマー化を検証する野生型HASBTと共発現すると、支配的な陰性効果を示しました。合わせて、我々のデータは、システインを介した共有結合に関係なく、HASBT二量体と高次オリゴマーの機能的存在を最終的に実証し、それにより膜表面でのトポロジカルアセンブリをより深く理解します。

The human apical sodium-dependent bile acid transporter, hASBT/SLC10A2, plays a central role in cholesterol homeostasis via the efficient reabsorption of bile acids from the distal ileum. hASBT has been shown to self-associate in higher order complexes, but while the functional role of endogenous cysteines has been reported, their implication in the oligomerization of hASBT remains unresolved. Here, we determined the self-association architecture of hASBT by site-directed mutagenesis combined with biochemical, immunological and functional approaches. We generated a cysteine-less form of hASBT by creating point mutations at all 13 endogenous cysteines in a stepwise manner. Although Cysless hASBT had significantly reduced function correlated with lowered surface expression, it featured an extra glycosylation site that facilitated its differentiation from wt-hASBT on immunoblots. Decreased protein expression was associated with instability and subsequent proteasome-dependent degradation of Cysless hASBT protein. Chemical cross-linking of wild-type and Cysless species revealed that hASBT exists as an active dimer and/or higher order oligomer with apparently no requirement for endogenous cysteine residues. This was further corroborated by co-immunoprecipitation of differentially tagged (HA-, Flag-) wild-type and Cysless hASBT. Finally, Cysless hASBT exhibited a dominant-negative effect when co-expressed with wild-type hASBT which validated heterodimerization/oligomerization at the functional level. Combined, our data conclusively demonstrate the functional existence of hASBT dimers and higher order oligomers irrespective of cysteine-mediated covalent bonds, thereby providing greater understanding of its topological assembly at the membrane surface.