哺乳類のBWZレポーター細胞におけるベータガラクトシダーゼ活性に基づくCPRGカリメトリックリガンド受容体シグナル伝達アッセイの改善

はじめに：レポーターを活性化するキメラ受容体を発現するレポーター細胞は、リガンドを介したシグナル伝達のスクリーニングに使用できます。この研究では、キメラ受容体が刺激されたときにβ-ガラクトシダーゼを発現するNFAT/LACZコンストラクトを抱えるレポーター細胞を使用しました。カリメトリックβ-ガラクトシダーゼ基質であるクロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド（CPRG）を使用して、酵素活性を検出しました。残念ながら、そのようなレポーターベースのβ-ガラクトシダーゼアッセイでは、残念ながら広範囲に広く報告されています。ここでは、受容体リガンドをレポーター細胞で効果的にスクリーニングできるように、CPRGベースの比色アッセイを改善することを目指しました。 方法：レポーター細胞の刺激後、β-ガラクトシダーゼ依存性CPRG加水分解の吸光度測定により、β-ガラクトシダーゼ活性を決定しました。このタイプのレポーター細胞について最も一般的に報告されている標準溶解バッファーの各成分を体系的に調べました。さらに、この分野の文献を評価しました。 結果：CPRG基質濃度の増加と、異なる洗剤であるサポニンと最適な波長記録を組み合わせたものと、β-ガラクトシダーゼ活性の検出の感度が著しく増加しました（約4倍の増加）。さらに、改善されたプロトコルは、細胞が溶解した後に酵素活性の線形時間依存記録を増加させ、レポーター細胞とのリガンド刺激を検出するためのより安定した再現性のあるアッセイをもたらしました。刺激への曝露の最適な時間の長さは、リガンド依存性でした。 議論：結論として、NFAT/LACZベースの受容体発現レポーター細胞が刺激にさらされると、最適化された溶解バッファーを備えた改良されたプロトコルを提供します。

INTRODUCTION: Reporter cells expressing a chimeric receptor that activates a reporter can be used for screening ligand-mediated signal transduction. In this study, we used reporter cells harboring an NFAT/lacZ construct that express β-galactosidase when the chimeric receptor is stimulated. A colorimetric β-galactosidase substrate, chlorophenol-red β-d-galactopyranoside (CPRG), was used to detect enzymatic activity. Sub-optimal conditions have unfortunately extensively been reported with such reporter-based β-galactosidase assays. Here, we aimed to improve the CPRG-based colorimetric assay such that receptor ligands could be effectively screened with reporter cells. METHODS: After stimulation of reporter cells, we determined β-galactosidase activity by absorbance measurement of β-galactosidase-dependent CPRG hydrolysis. We systematically examined each component in a standard lysis buffer most commonly reported for this type of reporter cells. Furthermore, we evaluated literature in the field. RESULTS: An increased CPRG substrate concentration combined with a different detergent, Saponin, and an optimal wavelength recording markedly increased the sensitivity for the detection of β-galactosidase activity (≈4-fold increase). Moreover, the improved protocol resulted in increased linear time-dependent recording of enzymatic activity once cells had been lysed, and a more stable and reproducible assay to detect a ligand-stimulus with the reporter cells. The optimal time length of exposure to a stimulus was ligand-dependent. DISCUSSION: In conclusion, we provide an improved protocol with an optimized lysis buffer that gives up to a six-fold higher and more robust specific signal when NFAT/lacZ-based receptor-expressing reporter cells are exposed to a stimulus.