緑色の微小藻類Chlorella kessleriからの新しいガラクトリパーゼ：精製、特性評価、分子クローニング、および異種発現

ミクロアルガクロレラケスレリにおいて、ジガラクトシルジアシルセリセロール（DGDG）などのガラクトリピッドのアシルエステル結合を加水分解する酵素であるガラクトリパーゼ（CKGL）を特定しました。細胞のない抽出物からの電気泳動性均一性に対する酵素の精製後、DGDGに対する最大活性がpH 6.5および37°Cで観察されました。CKGLはCa2+依存性酵素であり、見かけの分子量を約の見せかけました。SDS-PAGEの53 kDa。基質特異性は、DGDG（100％）>モノガラクトシルジアアシルグリセロール≈ホスファチジルグリセロール（〜40％）>スルホキノボシアアシルグリセロール（〜20％）;酵素は、グリセリドや他のリン脂質に向けてほとんど活性を示しませんでした。ガスクロマトグラフィー分析により、CKGLは好ましくは基質のSN-1アシルエステル結合を加水分解したことが示されました。CKGL遺伝子（指定GLP1）を含むゲノムDNA配列（5.6 kb）を決定し、cDNAをクローニングしました。GLP1は10個のイントロンと11個のエクソンで構成されており、1608 bpのフルレングスcDNAは、潜在的な葉緑体輸送ペプチドを含む妊娠前（60 AA）を含む475アミノ酸（AA）を含む成熟CKGLをコードしました。組換え官能性CKGLは、大腸菌で生成されました。CKGLの推定されたAA配列には、α/β-ヒドロラーゼの触媒トライアドの一部を形成する保存されたヒスチジンおよびアスパラギン酸残基の典型的なGXSXGモチーフが含まれていましたが、CKGLは、クラミドドゥムドゥドゥドゥドゥドゥドゥダナサスのGLSを含むGLSを含む既知のリパーゼとの有意な全体的な類似性を示しませんでした。ReinhardtiiとAspergillus japonicusは、CKGLが新しいGLであることを示しています。DGDGの特異性が高いCKGLは、材料テクスチャを改善できる酵素として食品加工に適用できます。

We have identified an enzyme, galactolipase (ckGL), which hydrolyzes the acyl ester bond of galactolipids such as digalactosyldiacylglycerol (DGDG), in the microalga Chlorella kessleri. Following purification of the enzyme to electrophoretic homogeneity from cell-free extract, the maximum activity toward DGDG was observed at pH 6.5 and 37 °C. ckGL was Ca2+-dependent enzyme and displayed an apparent molecular mass of approx. 53 kDa on SDS-PAGE. The substrate specificity was in the order: DGDG (100%) > monogalactosyldiacylglycerol ≈ phosphatidylglycerol (~ 40%) > sulfoquinovosyldiacylglycerol (~ 20%); the enzyme exhibited almost no activity toward glycerides and other phospholipids. Gas chromatography analysis demonstrated that ckGL preferably hydrolyzed the sn-1 acyl ester bond in the substrates. The genomic DNA sequence (5.6 kb) containing the ckGL gene (designated glp1) was determined and the cDNA was cloned. glp1 was composed of 10 introns and 11 exons, and the 1608-bp full-length cDNA encoded a mature ckGL containing 475 amino acids (aa), with a presequence (60 aa) containing a potential chloroplast transit peptide. Recombinant functional ckGL was produced in Escherichia coli. Although the deduced aa sequence of ckGL contained the typical GXSXG motif of serine hydrolases together with conserved histidine and aspartate residues which would form part of the catalytic triad of α/β-hydrolases, ckGL showed no significant overall similarity with known lipases including GLs from Chlamydomonas reinhardtii and Aspergillus japonicus, indicating that ckGL is a novel GL. ckGL, with high specificity for DGDG, could be applicable to food processing as an enzyme capable of improving material textures.