色とトポロジーが変化した遺伝的にエンコードされたグルタミン酸指標

グルタミン酸は20の一般的なアミノ酸の1つであり、神経系における化学的に媒介されたシナプス伝達にとって最も重要です。グルタミン酸の遺伝的エンコードされたインジケーターのカラーパレットを拡張するために、タンパク質エンジニアリングを使用して、赤色の強度ベースのグルタミン酸センシング蛍光レポーター（R-AglUSNFR1）を開発しました。R-AglusNFR1のトポロジーと以前に報告された緑色の蛍光インジケーターの操作により、非循環順順（NCP）バリアントが発生しました。R-およびRNCP-AGLUSNFR1は、それぞれ11μMと0.9μMのグルタミン酸塩の親和性を示します。これらのグルタミン酸指標は、HEK-293細胞の表面を標的とすると機能的であることを実証します。さらに、GNCP-AglusNFRが有機型海馬スライス培養におけるシナプス外グルタミン酸の信頼できる視覚化を可能にしたことを示し、R-AglusNFRは解離した植物性ニューロンの培養における電界刺激により、活動電界刺激による活動誘発性グルタミン酸トランジェントを確実に解決できます。

Glutamate is one of the 20 common amino acids and of utmost importance for chemically mediated synaptic transmission in nervous systems. To expand the color palette of genetically encoded indicators for glutamate, we used protein engineering to develop a red intensity-based glutamate-sensing fluorescent reporter (R-iGluSnFR1). Manipulating the topology of R-iGluSnFR1, and a previously reported green fluorescent indicator, led to the development of noncircularly permutated (ncp) variants. R- and Rncp-iGluSnFR1 display glutamate affinities of 11 μM and 0.9 μM, respectively. We demonstrate that these glutamate indicators are functional when targeted to the surface of HEK-293 cells. Furthermore, we show that Gncp-iGluSnFR enabled reliable visualization of extrasynaptic glutamate in organotypic hippocampal slice cultures, while R-iGluSnFR can reliably resolve action potential-evoked glutamate transients by electrical field stimuli in cultures of dissociated hippocampal neurons.