大腸菌のDNAポリメラーゼIIIのポリメラーゼサブユニットI DNAE遺伝子産物の増幅とアルファサブユニットのポリメラーゼ活性

DNAポリメラーゼIII（POL III）ホロ酵素のアルファサブユニットをコードする大腸菌DNAE遺伝子は、ファージラムダのPLプロモーターを含むプラスミドにクローン化され、アルファサブユニットを過剰生産するように熱的に誘導されます。このプラスミドを運ぶ細胞（PKH167）では、アルファサブユニットを熱誘導後、総細胞タンパク質の約0.2％のレベルに増幅しました。ポリメラーゼ活性は3つの方法でアッセイされました：（i）Pol IIIホロエンザイムおよびそのサブアセンブリによるギャップ充填、（ii）Pol IIIホロエンザイムのみによってのみプライミングされた一本鎖DNAサークルの広範な複製、および（iii）肉体、不整合性singed singed dnazeme neprcent dnazeme senptive singed dnazemeの補完（（iii）円。アルファサブユニットの増幅により、このポリペプチドに対するPol IIIギャップ充填活性の依存性を示すアッセイ（I）でポリメラーゼレベルが10倍になりました。Pol IIIホロエンザイム活性は影響を受けたままでした（アッセイ（II））が、補体活性は5倍に増加しました（アッセイ（III））。したがって、高されたアルファサブユニット（フリーまたはサブアセンブリ形式）は、Pol IIIホロエンザイムの欠陥のあるアルファサブユニットにin vitroを置き換えることができますが、細胞あたり約8ポールIIIホロエンザイム分子のin vivoレベルを増加させることはできません。この低レベルのPol IIIホロ酵素は、さまざまなアッセイから推測されるように、5倍過剰のアルファサブユニットの存在にもかかわらず、野生型細胞（プラスミドなし）に固定されています。これらの結果は、低レベルのPol IIIホロ酵素がアルファサブユニットのレベル以外の因子または因子によって決定されることを示唆しています。

The Escherichia coli dnaE gene, which encodes the alpha subunit of DNA polymerase III (pol III) holoenzyme, has been cloned in a plasmid containing the PL promoter of phage lambda and thermally induced to overproduce the alpha subunit. In cells carrying this plasmid (pKH167), the alpha subunit was amplified, after heat induction, to a level of about 0.2% of the total cellular protein. Polymerase activity was assayed in three ways: (i) gap-filling by pol III holoenzyme and subassemblies of it, (ii) the extensive replication of a primed, single-stranded DNA circle only by pol III holoenzyme, and (iii) complementation of a crude, inactive pol III holoenzyme (temperature-sensitive dnaE mutant fraction) in replication of a primed, single-stranded DNA circle. Amplification of the alpha subunit raised the polymerase level 10-fold in assay (i), indicative of the dependence of pol III gap-filling activity on this polypeptide; pol III holoenzyme activity remained unaffected (assay (ii)), but the complementation activity was raised 5-fold (assay (iii)). Thus, the elevated alpha subunit (free or in a subassembly form) can substitute in vitro for a defective alpha subunit in pol III holoenzyme, but cannot increase the in vivo level of about eight pol III holoenzyme molecules per cell. This low level of pol III holoenzyme is fixed in wild type cells (bearing no plasmid) despite the presence of a 5-fold excess of the alpha subunit, as inferred from the various assays. These results suggest that the low level of pol III holoenzyme is determined by a factor or factors other than the level of the alpha subunit.