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背景：遺伝的にエンコードされたカルシウムイオン（Ca2+）指標（GECIS）は、in vitroおよびin vivoでのCa2+ダイナミクスとニューロン活性を測定するための不可欠なツールです。赤蛍光タンパク質（RFP）ベースのGECIは、励起に使用される波長光が長いため、緑色の蛍光タンパク質ベースのGECIに比べて固有の利点があります。より長い波長光は、光毒性の低下と組織を介したより深い浸透に関連しています。Red Geciは、青またはシアンに興奮性のフルオロフォアによるマルチカラーの視覚化を有効にすることもできます。 結果：ここでは、Sea Anemone entacmaea Quadricolorに由来する円形の順列RFPに基づいて、新しいRFPベースのGECI、K-GECO1の開発、構造、および検証を報告します。培養HELA細胞、解離ニューロン、幹細胞由来の心筋細胞、器官型脳スライス、in vivoでのゼブラフィッシュ脊髄、およびin vivoでのマウス脳のK-GECO1の性能を特徴付けました。 結論：K-GECO1は、RFP EQFP578足場に基づくGECISの新しい系統の原型です。これは、リソソームの蓄積が減少し、青色光活性化を最小限に抑え、現在の最先端の指標の高感度と速い動態を提供します。K-GECO1系統のさらなる改良により、最も高度に最適化されたレッドジェシスのパフォーマンスを超える全体的な性能により、さらに改善されたバリアントにつながる可能性があります。
背景：遺伝的にエンコードされたカルシウムイオン（Ca2+）指標（GECIS）は、in vitroおよびin vivoでのCa2+ダイナミクスとニューロン活性を測定するための不可欠なツールです。赤蛍光タンパク質（RFP）ベースのGECIは、励起に使用される波長光が長いため、緑色の蛍光タンパク質ベースのGECIに比べて固有の利点があります。より長い波長光は、光毒性の低下と組織を介したより深い浸透に関連しています。Red Geciは、青またはシアンに興奮性のフルオロフォアによるマルチカラーの視覚化を有効にすることもできます。 結果：ここでは、Sea Anemone entacmaea Quadricolorに由来する円形の順列RFPに基づいて、新しいRFPベースのGECI、K-GECO1の開発、構造、および検証を報告します。培養HELA細胞、解離ニューロン、幹細胞由来の心筋細胞、器官型脳スライス、in vivoでのゼブラフィッシュ脊髄、およびin vivoでのマウス脳のK-GECO1の性能を特徴付けました。 結論：K-GECO1は、RFP EQFP578足場に基づくGECISの新しい系統の原型です。これは、リソソームの蓄積が減少し、青色光活性化を最小限に抑え、現在の最先端の指標の高感度と速い動態を提供します。K-GECO1系統のさらなる改良により、最も高度に最適化されたレッドジェシスのパフォーマンスを超える全体的な性能により、さらに改善されたバリアントにつながる可能性があります。
BACKGROUND: Genetically encoded calcium ion (Ca2+) indicators (GECIs) are indispensable tools for measuring Ca2+ dynamics and neuronal activities in vitro and in vivo. Red fluorescent protein (RFP)-based GECIs have inherent advantages relative to green fluorescent protein-based GECIs due to the longer wavelength light used for excitation. Longer wavelength light is associated with decreased phototoxicity and deeper penetration through tissue. Red GECI can also enable multicolor visualization with blue- or cyan-excitable fluorophores. RESULTS: Here we report the development, structure, and validation of a new RFP-based GECI, K-GECO1, based on a circularly permutated RFP derived from the sea anemone Entacmaea quadricolor. We have characterized the performance of K-GECO1 in cultured HeLa cells, dissociated neurons, stem-cell-derived cardiomyocytes, organotypic brain slices, zebrafish spinal cord in vivo, and mouse brain in vivo. CONCLUSION: K-GECO1 is the archetype of a new lineage of GECIs based on the RFP eqFP578 scaffold. It offers high sensitivity and fast kinetics, similar or better than those of current state-of-the-art indicators, with diminished lysosomal accumulation and minimal blue-light photoactivation. Further refinements of the K-GECO1 lineage could lead to further improved variants with overall performance that exceeds that of the most highly optimized red GECIs.
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