長鎖アルカンとアルコール生産のための大腸菌のモデル支援代謝工学

生物学的に由来する炭化水素は、現代のディーゼルとジェット燃料との化学的性質の類似性により、次世代のバイオ燃料として大きな可能性を秘めていると考えられています。ただし、バイオテクノロジー生産におけるこれらの炭化水素の収量が低いことは、商業化の大きな障害です。炭化水素の収量を増やすために、いくつかの遺伝的およびプロセス工学アプローチが採用されていますが、これまでのところモデル駆動型アプローチは実装されていません。ここでは、アルカン生合成のさまざまな需要が課される制約ベースの代謝モデリングアプローチを適用し、より高い鎖アルカン産生に向けてシアノバクテリア酵素をすでに発現している大腸菌株のさらなる工学のさらなる工学の潜在的な反応と見なされました。。課されたアルカン産生と共変化した反応は、主にペントースリン酸経路（PPP）と解糖の下半分に関連していることがわかった。グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（ZWF）によって触媒された反応を介して増加したフラックスを課し、ネットワークから7つの反応を繰り返し除去することにより、最適なモデリング溶液を達成し、珪藻によって決定された理論的最大変換の94.2％のアルカン収量をもたらしました。特定のバイオマス率での分析。インシリコの所見を検証するために、最初に、遺伝子のさまざまな用量を介して大腸菌のシアノバクテリア酵素の経路最適化を実施し、タンパク質融合を介して基質チャネリングを促進し、実質的な同等のタンパク質発現を誘導し、アルカの36倍の増加をもたらしました。e）2.8mg/lから102mg/lのNE生産。さらに、バイオマスの制約を含むインシリコ所見に基づく大腸菌の工学により、アルカ（e）ne力価が425mg/lに増加しました（主要成分は249mg/lペンタデカンおよび160mg/lヘプタデセンです）、それぞれ最初の株にわたって148.6倍の改善。理論上の最大値の34.2％の収率。モデル支援エンジニアリングの影響は、長鎖脂肪アルコールの生産についてもテストされました。これは、末端反応でのみ異なる間、同じ経路を共有する別の商業的に重要な分子を共有し、86.4の収量で1506mg/Lの力価を達成しました。理論的最大値の％。さらに、モデル支援系統株は、FREDバッチ栽培条件下でバイオリアクターで、それぞれ2.54g/Lと12.5g/Lの長鎖アルカンおよび脂肪アルコールを生成しました。私たちの研究は、大腸菌の長い鎖炭化水素の最高の力価を達成するための経路とプロセスの最適化とともに、シリコのモデリングアプローチを組み合わせた実装の成功を実証しました。

Biologically-derived hydrocarbons are considered to have great potential as next-generation biofuels owing to the similarity of their chemical properties to contemporary diesel and jet fuels. However, the low yield of these hydrocarbons in biotechnological production is a major obstacle for commercialization. Several genetic and process engineering approaches have been adopted to increase the yield of hydrocarbon, but a model driven approach has not been implemented so far. Here, we applied a constraint-based metabolic modeling approach in which a variable demand for alkane biosynthesis was imposed, and co-varying reactions were considered as potential targets for further engineering of an E. coli strain already expressing cyanobacterial enzymes towards higher chain alkane production. The reactions that co-varied with the imposed alkane production were found to be mainly associated with the pentose phosphate pathway (PPP) and the lower half of glycolysis. An optimal modeling solution was achieved by imposing increased flux through the reaction catalyzed by glucose-6-phosphate dehydrogenase (zwf) and iteratively removing 7 reactions from the network, leading to an alkane yield of 94.2% of the theoretical maximum conversion determined by in silico analysis at a given biomass rate. To validate the in silico findings, we first performed pathway optimization of the cyanobacterial enzymes in E. coli via different dosages of genes, promoting substrate channelling through protein fusion and inducing substantial equivalent protein expression, which led to a 36-fold increase in alka(e)ne production from 2.8 mg/L to 102 mg/L. Further, engineering of E. coli based on in silico findings, including biomass constraint, led to an increase in the alka(e)ne titer to 425 mg/L (major components being 249 mg/L pentadecane and 160 mg/L heptadecene), a 148.6-fold improvement over the initial strain, respectively; with a yield of 34.2% of the theoretical maximum. The impact of model-assisted engineering was also tested for the production of long chain fatty alcohol, another commercially important molecule sharing the same pathway while differing only at the terminal reaction, and a titer of 1506 mg/L was achieved with a yield of 86.4% of the theoretical maximum. Moreover, the model assisted engineered strains had produced 2.54 g/L and 12.5 g/L of long chain alkane and fatty alcohol, respectively, in the bioreactor under fed-batch cultivation condition. Our study demonstrated successful implementation of a combined in silico modeling approach along with the pathway and process optimization in achieving the highest reported titers of long chain hydrocarbons in E. coli.