ジスルフィド結合の直接質量分析特性

ジスルフィドの結合は、タンパク質の折りたたみと構造の安定性にとって重要です。抗体のジスルフィド結合の位置は、縮小および非還元ペプチドマッピングのクロマトグラムを衝突誘導解離（CID）質量分析（MS）/MSによって確認された位置識別と比較することにより、日常的に発見されます。ただし、ジスルフィド結合ペプチドのCID製品スペクトルを解釈することは困難であり、ジスルフィドループ内のバックボーン領域に関する限られた情報を提供することができます。ここでは、集中的なLC比較なしにジスルフィド結合を識別する電子移動解離（ETD）/CIDの組み合わせ断片化法を適用しましたが、ジスルフィドの位置を正確にマッピングしました。ネイティブタンパク質サンプルは、タンパク質分解のためにトリプシンを使用して消化されました。この方法は、Rapigest SF界面活性剤を使用し、還元/アルキル化と広範なサンプル操作の必要性を取り除きます。ダイジェストのアリコートをC4分析カラムにロードしました。Peptidesを勾配溶出し、ETDトリガーされたCID MS 3実験のThermo Scientific LTQ Orbitrapエリート質量分析計を使用して分析しました。調査MSスキャンの後に、調査スキャンで最も強いイオンでのETD MS2スキャンで構成されるデータ依存スキャンが続き、その後、ETD MS2スキャンの5つの最も強力なイオンで5つのMS3 CIDスキャンが続きました。λ軽鎖（IgG2λ）を使用した免疫グロブリンG2モノクローナル抗体（IgG2λ）を備えた、ジスルフィドを介した構造変異体AおよびA/B形態、およびそれらの対応するジスルフィド結合を識別することができました。

Disulfide linkage is critical to protein folding and structural stability. The location of disulfide linkages for antibodies is routinely discovered by comparing the chromatograms of the reduced and non-reduced peptide mapping with location identification confirmed by collision-induced dissociation (CID) mass spectrometry (MS)/MS. However, CID product spectra of disulfide-linked peptides can be difficult to interpret, and provide limited information on the backbone region within the disulfide loop. Here, we applied an electron-transfer dissociation (ETD)/CID combined fragmentation method that identifies the disulfide linkage without intensive LC comparison, and yet maps the disulfide location accurately. The native protein samples were digested using trypsin for proteolysis. The method uses RapiGest SF Surfactant and obviates the need for reduction/alkylation and extensive sample manipulation. An aliquot of the digest was loaded onto a C4 analytical column. Peptides were gradient-eluted and analyzed using a Thermo Scientific LTQ Orbitrap Elite mass spectrometer for the ETD-triggered CID MS 3 experiment. Survey MS scans were followed by data-dependent scans consisting of ETD MS2 scans on the most intense ion in the survey scan, followed by 5 MS3 CID scans on the 5 most intense ions in the ETD MS2 scan. We were able to identify the disulfide-mediated structural variants A and A/B forms and their corresponding disulfide linkages in an immunoglobulin G2 monoclonal antibody with λ light chain (IgG2λ), where the location of cysteine linkages were unambiguously determined.