in vivoでのピギーバックを介して、タンパク質 - スマルRNA相互作用を検出するための敏感なツールとしてのペルオキシソームターゲティング

ペルオキシソームは、真核生物代謝において重要な役割を果たすオルガネラです。それらのタンパク質補体は、ペルオキシソーム膜全体に折り畳まれたタンパク質とタンパク質複合体を移行できる独自の経路のおかげで、細胞質から完全に輸入されています。ペルオキシソームを標的としたタンパク質に結合した分子の輸入は、「ピギーバック」として知られる活性プロセスであり、最近、ペルオキシソームターゲティングシーケンスを持つウイルスエンコードタンパク質であるP15がペルオキシソームに豚肉に入ることができることを示しました。ここでは、p15発現植物のペルオキシソームに見られる小さなRNAレパートリーを分析することにより、この観察を拡張します。免疫沈降（IP）実験中に回収されたP15関連の小RNAとの直接的な比較により、ペルオキシソームの分離と結合したin vivoピギーバックは、特定のタンパク質に結合したさまざまな小さなRNA種を決定するためのより敏感な手段であることが明らかになりました。IP実験とは対照的に、ペルオキシソーム分離のこの感度の増加は、ペルオキシソームを人工的に標的とするRNAサイレンシング（VSR）の最も特徴的なウイルスサプレッサーの1つであるトマトのふさふさしたウイルスエンコードP19に縛られた小さなRNA集団を分析したときに顕著でした。これらの結果は、ペルオキシソームの標的化は、不安定な結合イベントの検出を可能にするin vivo相互作用を評価するための新規/代替の実験的アプローチと見なされるべきであることを裏付けています。このアプローチの利点と制限について説明します。

Peroxisomes are organelles that play key roles in eukaryotic metabolism. Their protein complement is entirely imported from the cytoplasm thanks to a unique pathway that is able to translocate folded proteins and protein complexes across the peroxisomal membrane. The import of molecules bound to a protein targeted to peroxisomes is an active process known as 'piggybacking' and we have recently shown that P15, a virus-encoded protein possessing a peroxisomal targeting sequence, is able to piggyback siRNAs into peroxisomes. Here, we extend this observation by analyzing the small RNA repertoire found in peroxisomes of P15-expressing plants. A direct comparison with the P15-associated small RNA retrieved during immunoprecipitation (IP) experiments, revealed that in vivo piggybacking coupled to peroxisome isolation could be a more sensitive means to determine the various small RNA species bound by a given protein. This increased sensitivity of peroxisome isolation as opposed to IP experiments was also striking when we analyzed the small RNA population bound by the Tomato bushy stunt virus-encoded P19, one of the best characterized viral suppressors of RNA silencing (VSR), artificially targeted to peroxisomes. These results support that peroxisomal targeting should be considered as a novel/alternative experimental approach to assess in vivo interactions that allows detection of labile binding events. The advantages and limitations of this approach are discussed.