リジン結合抗体薬物コンジュゲートの生物物理学的特性と加熱誘導凝集

市販の抗体剤薬物コンジュゲート（ADC）産物であるKadcyla®は、2段階の反応を使用して合成されます。これにより、リンカーはステップ1のMAB上のネイティブリジンに共役し、その後、ステップでリンカー修飾抗体への薬物共役が続きます。2.私たちの研究では、1段階の反応を使用して、Kadcyla®と同じトラスツズマブ足場でリジン結合ADC（Syn-ADC）を合成しました。両方の製品の質量分析により、mAbに結合した遊離リンカーを含むKadcyla®の亜集団が明らかになりましたが、1段階の反応ADC産物には存在しない薬物に結合しませんでした。微分走査熱量測定サーモグラムは、薬物とリンカーの結合が、ADCのCH2ドメインの変性のための熱安定性と活性化のエネルギーを大幅に低下させることを示しました。加熱誘導凝集イベントは、Herceptin®の71°Cと比較して、それぞれKadcyla®とSyn-ADCで〜57°Cと〜45°Cという早い時期に始まりました。コロイドの安定性測定は、ADCの疎水性薬物ペイロードが、製剤緩衝条件下での非結合抗体と比較した場合、反発性間相互作用を大幅に減少させることを明確に示しています（pH 6.0）。疎水性薬物およびリンカーの部分を抗体に付着させると、熱安定性とコロイド安定性が低下し、ADCの凝集傾向が増加しました。

The commercially available antibody-drug conjugate (ADC) product, Kadcyla® is synthesized using a 2-step reaction, wherein the linker is conjugated to native lysines on the mAb in step 1, followed by drug conjugation to the linker-modified antibody in step 2. In our study, we synthesized a lysine-conjugated ADC (Syn-ADC) on the same trastuzumab scaffold as Kadcyla® using a 1-step reaction. Mass spectrometry of both products revealed a subpopulation of Kadcyla® containing free linkers conjugated to the mAb, but not conjugated to the drug, which were absent in the 1-step reaction ADC product. Differential scanning calorimetry thermograms showed that the drug and linker conjugation significantly reduced the thermal stability and energies of activation for the denaturation of the CH2 domain of the ADCs. The heating induced aggregation events started as early as ∼57°C and ∼45°C for Kadcyla® and Syn-ADC, respectively, compared with 71°C for Herceptin®. The colloidal stability measurements clearly showed that the hydrophobic drug payload on ADCs significantly reduced the repulsive interprotein interactions when compared to the unconjugated antibody under formulation buffer conditions (pH 6.0). Attaching hydrophobic drug and linker moieties onto the antibody lowered the thermal and colloidal stabilities and increased the aggregation propensity of the ADCs.