活性ベースのE3リガーゼプロファイリングは、E3リガーゼをエステル化活動で明らかにします

ユビキチン化は、ユビキチン活性化酵素（E1）からユビキチン結合酵素（E2）へのユビキチン（UB）の移動により、共有結合された中間体（E2-UB）1を産生します。「本当に興味深い新しい遺伝子」（RING）クラスのユビキチンリガーゼ（E3S）は、リングドメインを介してE2-UBをリクルートし、ユビキチンの基質への直接転送を媒介します2。対照的に、「E6-AP Carboxy Terminusと相同」（HECT）E3リガーゼは、E2-UBと触媒システイン依存性透過反応を受け、共有E3-UB中間中間体を形成します3,4。さらに、リングリング（RBR）E3リガーゼには、補助ドメインにリンクされた標準リングドメインがあります。この補助ドメインには、ハイブリッドリングヘクトメカニズムを可能にする触媒システインが含まれています5。ユビキチン化は、通常、非リジン活性を持つ既知のヒトE3リガーゼがないため、リジン残基の翻訳後修飾と見なされます。ここでは、HECTまたはRBR様E3リガーゼの活性ベースのタンパク質プロファイリングを実行し、エステル化活性とセリン上のスレオニンの内在性選択性を備えたリングリンクE3リガーゼの見かけの単一メンバーとして、ニューロン関連E3リガーゼMYCBP2（PHR1としても知られています）を特定します。MyCBP2には、ユビキチンをチオエステル中間体を介してその基質にリレーする2つの必須触媒システイン残基が含まれています。リングCys-lelay（RCR）を指定するこのクラスのE3リガーゼの結晶学的特性は、そのメカニズムとスレオニン選択性に関する洞察を提供します。これらの発見は、より高い真核生物の細胞調節における非リジンユビキチン化を巻き込み、E3酵素が非評価されていない機械的多様性を持っていることを示唆しています。

Ubiquitination is initiated by transfer of ubiquitin (Ub) from a ubiquitin-activating enzyme (E1) to a ubiquitin-conjugating enzyme (E2), producing a covalently linked intermediate (E2-Ub) 1 . Ubiquitin ligases (E3s) of the 'really interesting new gene' (RING) class recruit E2-Ub via their RING domain and then mediate direct transfer of ubiquitin to substrates 2 . By contrast, 'homologous to E6-AP carboxy terminus' (HECT) E3 ligases undergo a catalytic cysteine-dependent transthiolation reaction with E2-Ub, forming a covalent E3-Ub intermediate3,4. Additionally, RING-between-RING (RBR) E3 ligases have a canonical RING domain that is linked to an ancillary domain. This ancillary domain contains a catalytic cysteine that enables a hybrid RING-HECT mechanism 5 . Ubiquitination is typically considered a post-translational modification of lysine residues, as there are no known human E3 ligases with non-lysine activity. Here we perform activity-based protein profiling of HECT or RBR-like E3 ligases and identify the neuron-associated E3 ligase MYCBP2 (also known as PHR1) as the apparent single member of a class of RING-linked E3 ligase with esterification activity and intrinsic selectivity for threonine over serine. MYCBP2 contains two essential catalytic cysteine residues that relay ubiquitin to its substrate via thioester intermediates. Crystallographic characterization of this class of E3 ligase, which we designate RING-Cys-relay (RCR), provides insights into its mechanism and threonine selectivity. These findings implicate non-lysine ubiquitination in cellular regulation of higher eukaryotes and suggest that E3 enzymes have an unappreciated mechanistic diversity.