ヒト好中球カテプシンGの切断特異性の拡張：デュアルキマーゼとトリプターゼ型の特異性を備えた低活性プロテアーゼ

ヒト好中球は、少なくとも4つの活性セリンプロテアーゼ、カテプシンG、N-エラスターゼ、プロテイナーゼ3および好中球セリンプロテアーゼ4（NSP4）を発現します。それらはすべて、好中球生物学と免疫における彼らの重要性のためにすべて広く研究されています。ただし、それらの拡張された切断の特異性は、詳細に決定されたことはありません。ここでは、ヒトカテプシンG（HCG）の詳細な切断特異性分析を提示します。特異性はファージディスプレイ分析によって決定され、切断部位と周辺の個々のアミノ酸の重要性は、新しい組換え基質を使用して検証されました。このセリンプロテアーゼにより広いコンテキストを提供するために、関連するマスト細胞プロテアーゼであるヒトキマーゼ（HC）と比較が行われました。HCGは、一次特異性と拡張特異性の両方を含むHCに同様の特性を示しました。予想どおり、PHE、TYR、TRP、およびLEUがP1位置で好まれました。さらに、両方のプロテアーゼは、基質のp2の位置にある負に帯電したアミノ酸の好みと、切断部位の上流と下流の両方で脂肪族アミノ酸の好みを示しました。ただし、全体的にHCGの触媒活性はHCよりも10倍低かった。HCGは以前、キマーゼおよびトリプターゼ型活性からなる二重特異性を持っていると報告されています。私たちの分析では、P1切断位置のLYSを持つ基質に対するトリプターゼ活性は、強いデュアルタイプの特異性をサポートする最適なキマーゼ基質と比較して、実際には2倍効率が低かった。HCGおよびHCの拡張切断特異性に関する情報が、これらのプロテアーゼのin vivo基質の新規の検索を支援し、免疫および細菌防御におけるHCGの役割をよりよく理解するための努力を支援することを願っています。

Human neutrophils express at least four active serine proteases, cathepsin G, N-elastase, proteinase 3 and neutrophil serine protease 4 (NSP4). They have all been extensively studied due to their importance in neutrophil biology and immunity. However, their extended cleavage specificities have never been determined in detail. Here we present a detailed cleavage specificity analysis of human cathepsin G (hCG). The specificity was determined by phage display analysis and the importance of individual amino acids in and around the cleavage site was then validated using novel recombinant substrates. To provide a broader context to this serine protease, a comparison was made to the related mast cell protease, human chymase (HC). hCG showed similar characteristics to HC including both the primary and extended specificities. As expected, Phe, Tyr, Trp and Leu were preferred in the P1 position. In addition, both proteases showed a preference for negatively charged amino acids in the P2´ position of substrates and a preference for aliphatic amino acids both upstream and downstream of the cleavage site. However, overall the catalytic activity of hCG was ~10-fold lower than HC. hCG has previously been reported to have a dual specificity consisting of chymase and tryptase-type activities. In our analysis, tryptase activity against substrates with Lys in P1 cleavage position was indeed only 2-fold less efficient as compared to optimal chymase substrates supporting strong dual-type specificity. We hope the information presented here on extended cleavage specificities of hCG and HC will assist in the search for novel in vivo substrates for these proteases as well as aid in the efforts to better understand the role of hCG in immunity and bacterial defence.