老化したヒトレンズからのβb2-クリスタリンにおける異性体アスパラギン酸残基の同定

酸化、脱アミド化、アミノ酸残基の異性化などの多くの翻訳後修飾は、老化を伴うレンズタンパク質で発生します。そのような修飾の1つであるレンズα-クリスタリンにおけるアスパラギン酸の異性化は、アミノ酸エナンチオマー分析とLC-MS/MSによってよく研究されています。LC-MS/MSは、レンズタンパク質混合物を精製することなく、DおよびL-アミノ酸含有ペプチドを迅速かつ簡単に識別できます。ただし、この方法には、主要成分の異性体ペプチドが主に検出されるという弱点がありますが、β-クリスタリンやγ-クリスタリンなどのマイナーなタンパク質からのものは完全に測定されていません。したがって、β-クリスタリンファミリーおよびγ-クリスタリンファミリーにおけるアミノ酸残基の異性化はほとんど研究されていません。これらの問題を解決し、β-クリスタリンファミリーの主要成分であるレンズβB2-クリスタリンのASP残基の異性化を検出するために、ここでは、LC-MS/MSまたはアミノのいずれかに基づくD/L分析の前にサンプル分別のためのステップを開発しました。ジアステレオイソマーへの酸誘導体化に続いてRP-HPLCが続きます。少量のペプチドをキャプチャするために、四重極MS/MS（Q-MS）に基づく複数の反応モニタリング（MRM）メソッドが、レンズ全体の水溶性画分に適用されました。LC-MS/MSとDiastereoisomerの両方の形成に基づくD/L分析は、老化したレンズのβB2-クリスタリンにおけるASP4、ASP83、ASP92、ASP192を含む複数の異性化部位の存在を示しました。これらの異性化部位は、Q-MSによって年齢依存的に存在することが確認されました。ASPの異なる異性体を含むβB2-クリスタリンの合成ペプチドは、RP-HPLC中に異なる溶出プロファイルを示し、ASP異性体を含むペプチドの局所構造または疎水性の違いを示しています。これらの結果は、異性化部位がβB2-クリスタリンの露出領域に分布しているため、結晶サブユニットサブユニットの相互作用に影響を与え、異常なクリスタリン凝集を誘発し、老化したレンズの老化性白内障形成に寄与する可能性が高いことを示唆しています。

Many post-translational modifications such as oxidation, deamidation and isomerization of amino acid residues occur in lens proteins with aging. One such modification, isomerization of aspartate in lens α-crystallin, has been well studied by amino acid enantiomer analysis and LC-MS/MS. LC-MS/MS can quickly and easily identify D- and L-amino acid-containing peptides without purification of lens protein mixtures. However, this method has a weak point in that isomeric peptides of major components are detected predominantly, while those from minor proteins such as β- and γ-crystallins have not been fully determined. Therefore, the isomerization of amino acid residues in β- and γ-crystallin families has been little studied. To solve those problems and detect the isomerization of Asp residues in lens βB2-crystallin, the main component of the β-crystallin family, here we have developed steps for sample fractionation before d/l analysis based on either LC-MS/MS or amino acid derivatization to diastereoisomers followed by RP-HPLC. To capture a small amount of peptide, a multiple reaction monitoring (MRM) method based on quadrupole MS/MS (Q-MS) was applied to the water-soluble fraction of whole lens. The d/l analysis based on both LC-MS/MS and diastereoisomer formation showed the presence of multiple isomerization sites, including Asp4, Asp83, Asp92 and Asp192, in βB2-crystallin in aged lens. These isomerization sites were confirmed to exist in an age-dependent manner by Q-MS. Synthetic peptides of βB2-crystallin containing different isomers of Asp showed differential elution profiles during RP-HPLC, indicating differences in the local structure or hydrophobicity of Asp-isomer-containing peptides. These results suggest that the isomerization sites are distributed on exposed regions of βB2-crystallin and thus likely to have an impact on crystallin subunit-subunit interactions, induce abnormal crystallin aggregation, and contribute to senile cataract formation in aged lens.