CRISPR/CAS9媒介GFPノックイン293フィートの細胞のMAP1LC3B遺伝子座でのノックインは、細胞オートファジーの真正なモニタリングに適しています

生理学的および病理学的プロセスにおけるオートファジーの重要性がますます明らかになるため、細胞のオートファジーを正確に識別して定量化することは非常に重要です。異所に発現した蛍光タグ付き微小管関連タンパク質ライトチェーン3B（MAP1LC3B、LC3）は、これまでのオートファジー活性を監視するために最も広く使用されているレポーターです。ただし、このアプローチは、オートファジー自体とオートファジー関連のプロセスに対する構成的に過剰発現したLC3の影響を無視し、オートファジーを示す際のその精度は疑わしい。ここでは、293フィート細胞のCRISPR/CAS9システムを介してノックインGFP-LC3レポーターを生成し、GFPを内因性LC3のN末端およびフレームに追加しました。このノックインGFP-LC3は、内因性転写調節要素が野生型対立遺伝子として駆動される生物学的レベルで発現したことを証明しました。異所に発現したGFP-LC3と比較して、内因性ノックインレポーターは、オートファジー活性を監視するための特定のステップでのオートファジーの誘導または阻害時に、GFP-LC3 Punctaの感度とシグナルとノイズとノイズの比率がはるかに高いことを示しました。したがって、ここで提示された以前の報告された報告によれば、このノックインGFP-LC3レポーターは、in vitroおよびin vivoでのオートファジーのさらなる研究のために、真正な監視に適していることを示唆しています。

Accurately identifying and quantifying cellular autophagy is very important as the significance of autophagy in physiological and pathological processes becomes increasingly evident. Ectopically expressed fluorescent-tagged microtubule-associated protein light chain 3B (MAP1LC3B, LC3) is the most widely used reporter for monitoring autophagy activity thus far. However, this approach ignores the influence of constitutively overexpressed LC3 on autophagy itself and autophagy-related processes and its accuracy in indicating autophagy is questionable. Here, we generated a knock-in GFP-LC3 reporter via the CRISPR/Cas9 system in 293FT cells to add GFP to the N-terminal of and in frame with endogenous LC3. We proved that this knock-in GFP-LC3 was expressed at biological level driven by the endogenous transcriptional regulatory elements as the wild type alleles. Compared with the ectopically expressed GFP-LC3, the endogenous knock-in reporter exhibited much higher sensitivity and signal-to-noise ratio of GFP-LC3 puncta upon the induction or inhibition of autophagy at certain step for monitoring autophagy activity. Thus, according to the previous reported concerning and the results presented here, we suggest that this knock-in GFP-LC3 reporter is better for bona fide monitoring cellular autophagy and should be employed for further study of autophagy in vitro and in vivo.