リアノジン受容体Ca2+リリースチャネルの阻害剤を特定するための小胞体Ca2+測定による効率的なハイスループットスクリーニング

リアノジン受容体（RYR）の遺伝的変異、筋肉収縮に不可欠な筋細胞質網状体のCa2+リリースチャネルは、さまざまな骨格筋と心臓病を引き起こします。病因の主な根本メカニズムは、RYRチャネルの機能獲得によるCa2+の過活動的な放出であるため、RYRの阻害はこれらの疾患の有望な治療法であると予想されます。ここでは、骨格筋1型RYR（RYR1）に特異的な阻害剤を特定するために、小胞体（ER）のCa2+濃度のタイムラプス蛍光測定を使用して、新しいハイスループットスクリーニング（HTS）プラットフォームを開発しました（[CA2+] ER）。疾患関連の変異を運ぶRyr1の発現は、Ryr1チャネルからのCa2+漏れを介してHEK293細胞の[Ca2+] ERを減少させるため、Ryr1を阻害する特定の薬物は、そのようなCa2+漏れを防ぐことで[Ca2+] ERを増加させます。遺伝的にコードされたER Ca2+指標であるR2163C変異とR-CEPIA1ERを運ぶRYR1は、HEK293細胞で安定して発現し、フルオロメーターを使用してタイムラプス蛍光を測定しました。誤検知は、野生型（WT）RYR1を発現する細胞を使用して効果的に除外されました。よく特徴付けられた薬物のライブラリーで1535の化合物をスクリーニングすることにより、既知のRyR1阻害剤であるDantroleneを含む[Ca2+] ERを有意に増加させる4つの化合物を正常に特定しました。オキソリン酸を除くすべてのヒット化合物は、WTおよび変異RyR1のリアノジン結合を阻害しました。興味深いことに、彼らは異なる用量依存性とアイソフォームの特異性を示しました。高度な定量的性質とチャネル活動との良好な相関は、RYR関連疾患の薬物を探索するために[Ca2+] ER測定によってこのHTSプラットフォームを検証しました。

Genetic mutations in ryanodine receptors (RyRs), Ca2+-release channels in the sarcoplasmic reticulum essential for muscle contractions, cause various skeletal muscle and cardiac diseases. Because the main underlying mechanism of the pathogenesis is overactive Ca2+ release by gain-of-function of the RyR channel, inhibition of RyRs is expected to be a promising treatment of these diseases. Here, to identify inhibitors specific to skeletal muscle type 1 RyR (RyR1), we developed a novel high-throughput screening (HTS) platform using time-lapse fluorescence measurement of Ca2+ concentrations in the endoplasmic reticulum (ER) ([Ca2+]ER). Because expression of RyR1 carrying disease-associated mutation reduces [Ca2+]ER in HEK293 cells through Ca2+ leakage from RyR1 channels, specific drugs that inhibit RyR1 will increase [Ca2+]ER by preventing such Ca2+ leakage. RyR1 carrying the R2163C mutation and R-CEPIA1er, a genetically encoded ER Ca2+ indicator, were stably expressed in HEK293 cells, and time-lapse fluorescence was measured using a fluorometer. False positives were effectively excluded by using cells expressing wild-type (WT) RyR1. By screening 1535 compounds in a library of well characterized drugs, we successfully identified four compounds that significantly increased [Ca2+]ER They include dantrolene, a known RyR1 inhibitor, and three structurally different compounds: oxolinic acid, 9-aminoacridine, and alexidine. All the hit compounds, except for oxolinic acid, inhibited [3H]ryanodine binding of WT and mutant RyR1. Interestingly, they showed different dose dependencies and isoform specificities. The highly quantitative nature and good correlation with the channel activity validated this HTS platform by [Ca2+]ER measurement to explore drugs for RyR-related diseases.