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細胞のアクチン細胞骨格を画像化すると、幅広いアプローチが使用されます。通常、小循環ペプチドファロイジンの蛍光誘導体を使用して、固定細胞のF-アクチンを画像化します。寿命とf-tractinは、生細胞の細胞骨格を画像化するために人気があります。ここでは、in vitroでF-アクチンに特異的に結合するアフィマーと呼ばれる新規親和性試薬を特徴づけて、それらがEGFP融合タンパク質として適切な代替品であるかどうかを判断し、ライブ細胞にアクチンを標識するか、固定細胞にF-アクチンを標識するようにしました。in vitroの実験では、4人のアファイマーのうち3人（affimers 6、14、24）が精製されたF-アクチンにしっかりと結合し、結合部位が重複しているように見えることが示されました。EGFP融合タンパク質として、同じ3人のアファイマーが生細胞にF-アクチンをラベル付けします。FRAP実験は、EGFPアフィマー6がF-Tractinおよび寿命と最も同様の動作であることを示唆しています。ただし、動的なフリルではMCHERRY-ACTINと共局在することはなく、安定したアクチンフィラメントに優先的に結合する可能性があります。4人のアフィマー全員がメタノール固定細胞にF-アクチンをラベル付けしますが、アフマー14のみがパラホルムアルデヒド固定後にF-アクチンをラベル付けします。EGFPアフィマー6は、生細胞の安定したアクチン細胞骨格を選択的にイメージングする際に使用できる可能性がありますが、4つのアフィマーはすべて、固定細胞のF-アクチンを標識するためのファロイジンの強力な代替品です。
細胞のアクチン細胞骨格を画像化すると、幅広いアプローチが使用されます。通常、小循環ペプチドファロイジンの蛍光誘導体を使用して、固定細胞のF-アクチンを画像化します。寿命とf-tractinは、生細胞の細胞骨格を画像化するために人気があります。ここでは、in vitroでF-アクチンに特異的に結合するアフィマーと呼ばれる新規親和性試薬を特徴づけて、それらがEGFP融合タンパク質として適切な代替品であるかどうかを判断し、ライブ細胞にアクチンを標識するか、固定細胞にF-アクチンを標識するようにしました。in vitroの実験では、4人のアファイマーのうち3人（affimers 6、14、24）が精製されたF-アクチンにしっかりと結合し、結合部位が重複しているように見えることが示されました。EGFP融合タンパク質として、同じ3人のアファイマーが生細胞にF-アクチンをラベル付けします。FRAP実験は、EGFPアフィマー6がF-Tractinおよび寿命と最も同様の動作であることを示唆しています。ただし、動的なフリルではMCHERRY-ACTINと共局在することはなく、安定したアクチンフィラメントに優先的に結合する可能性があります。4人のアフィマー全員がメタノール固定細胞にF-アクチンをラベル付けしますが、アフマー14のみがパラホルムアルデヒド固定後にF-アクチンをラベル付けします。EGFPアフィマー6は、生細胞の安定したアクチン細胞骨格を選択的にイメージングする際に使用できる可能性がありますが、4つのアフィマーはすべて、固定細胞のF-アクチンを標識するためのファロイジンの強力な代替品です。
Imaging the actin cytoskeleton in cells uses a wide range of approaches. Typically, a fluorescent derivative of the small cyclic peptide phalloidin is used to image F-actin in fixed cells. Lifeact and F-tractin are popular for imaging the cytoskeleton in live cells. Here we characterised novel affinity reagents called Affimers that specifically bind to F-actin in vitro to determine if they are suitable alternatives as eGFP-fusion proteins, to label actin in live cells, or for labeling F-actin in fixed cells. In vitro experiments showed that 3 out of the 4 Affimers (Affimers 6, 14 and 24) tested bind tightly to purified F-actin, and appear to have overlapping binding sites. As eGFP-fusion proteins, the same 3 Affimers label F-actin in live cells. FRAP experiments suggest that eGFP-Affimer 6 behaves most similarly to F-tractin and Lifeact. However, it does not colocalise with mCherry-actin in dynamic ruffles, and may preferentially bind stable actin filaments. All 4 Affimers label F-actin in methanol fixed cells, while only Affimer 14 labels F-actin after paraformaldehyde fixation. eGFP-Affimer 6 has potential for use in selectively imaging the stable actin cytoskeleton in live cells, while all 4 Affimers are strong alternatives to phalloidin for labelling F-actin in fixed cells.
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