ヒト宿主細胞による内在化後の細菌病原体からのRNAの選択的回復

宿主内の接着、内在化、生存中に、病原体とヒト細胞の複雑な混合物内の細菌遺伝子発現を研究するときに、選択的RNA抽出が必要です。RNAの大部分は真核生物宿主細胞からのものであるため、細菌のRNAの量を豊かにするために新しい技術を開発および実装する必要があります。これにより、宿主細胞の防御に対する細菌の適応、およびそれらが細胞内生活にどのように適応するかについての理解が向上します。ここでは、RNA抽出プロトコルを提示して、ジルコニウムビーズを使用して最小限のRNA分解を使用して、ヒト細胞と細菌細胞の混合物から最低細菌RNA画分を選択的に濃縮します。ジルコニウムビーズは、病原体の内在化後にガラスビーズよりも細菌RNAを抽出する能力が高い。最適な細菌溶解とRNA抽出のために、ビーズのサイズと組成を最適化しました。このプロトコルは、2つのヒト細胞株、分化したマクロファージと骨芽細胞で検証され、グラム陽性（黄色ブドウ球菌）または陰性の（サルモネラチフヒムリウム）細菌のいずれかで検証されました。他の公開されたプロトコルと比較して、総RNA回復の収率は大幅に改善されましたが、宿主細胞感染は細菌の接種が低いことで実施されました。宿主内では、細菌のRNA回収率は純粋な細菌からのRNA抽出よりも6倍低かったが、回収されたRNAの品質は本質的に類似していた。細菌RNAの回復は、おそらく真核生物細胞溶解の初期段階でグラム陽性細胞壁によるより高い保護のために、S。typhimuriumよりも黄色ブドウ球菌の方が効率的でした。これらの精製された細菌RNAは、宿主細胞 - 菌と相互作用の過程で、その後の遺伝子発現研究を可能にします。

Selective RNA extractions are required when studying bacterial gene expression within complex mixtures of pathogens and human cells, during adhesion, internalization and survival within the host. New technologies should be developed and implemented to enrich the amount of bacterial RNAs since the majority of RNAs are from the eukaryotic host cells, requiring high read depth coverage to capture the bacterial transcriptomes in dual-RNAseq studies. This will improve our understanding about bacterial adaptation to the host cell defenses, and about how they will adapt to an intracellular life. Here we present an RNA extraction protocol to selectively enrich the lowest bacterial RNA fraction from a mixture of human and bacterial cells, using zirconium beads, with minimal RNA degradation. Zirconium beads have higher capacity to extract bacterial RNAs than glass beads after pathogen internalization. We optimized the beads size and composition for an optimal bacterial lysis and RNA extraction. The protocol was validated on two human cell lines, differentiated macrophages and osteoblasts, with either Gram-positive (Staphylococcus aureus) or -negative (Salmonella typhimurium) bacteria. Relative to other published protocols, yield of total RNA recovery was significantly improved, while host cell infection was performed with a lower bacterial inoculum. Within the host, bacterial RNA recovery yields were about six-fold lower than an RNA extraction from pure bacteria, but the quality of the RNA recovered was essentially similar. Bacterial RNA recovery was more efficient for S. aureus than for S. typhimurium, probably due to their higher protection by the Gram-positive cell walls during the early step of eukaryotic cell lysis. These purified bacterial RNAs allow subsequent genes expression studies in the course of host cell-bacteria interactions.