低入力RNAを使用した市販の小さなRNaseqライブラリ準備キットの評価

背景：小さな組織生検および循環バイオ流体に存在する小型RNAの全範囲を包括的にプロファイリングすることへの進化的関心、および疾患とプロファイルがどのように異なるかは、より頻繁な使用に小さなRNAシーケンス（RNASEQ）を発射しました。ただし、低いRNA入力によって悪化した小さなRNaseQに関連する既知のバイアスは、重大な懸念であり、広範な採用に対するハードルの両方でした。RNASEQは、低入力サンプルとより多くのラボでの小さなRNAの発見に実行可能な選択肢になりつつあるため、新しいシーケンスプロトコルとオペレーターのパフォーマンスをテストおよび評価するためのベンチマークデータセットが必要です。国立標準技術研究所であるPine et al。、2018からの最近の出版物で、調査官は3つの組織の市販のセットを使用し、ラボとプラットフォームでパフォーマンスをテストしました。 結果：この論文では、一般的に使用され、市販の3つのRNASEQライブラリ準備キットの低RNA入力の性能をさらにテストしました。Neb Next、NextFlex、およびTruseq Small RNAライブラリーの準備。2つの異なる部位でキットの性能を評価し、3つの異なる組織（脳、肝臓、胎盤）を使用して、組織サンプルからの高（1μg）および低RNA（10 ng）入力を使用して、5.0、3.0、2.0、1.0を使用して評価しました。、0.5、および0.2 mLのプラズマの開始容積。差次的に発現したmiRNAの堅牢な検証プラットフォームが不足しているため、低入力RNaseQデータと3つの異なるプラットフォーム（ABCAM Fireplex、HTG EDGESEQ、およびQIAGEN MIRNOME）での式プロファイルと比較しました。 結論：これらの3つのプラットフォームでのRNaseqの結果の一致は、RNA発現レベルに依存していました。表現が高いほど、再現性が向上します。この結果は、低RNA入力を使用した小さなRNaseQキットのパフォーマンスの広範な分析と、3つのダウンストリームテクノロジーでのこれらのデータの複製を提供します。

BACKGROUND: Evolving interest in comprehensively profiling the full range of small RNAs present in small tissue biopsies and in circulating biofluids, and how the profile differs with disease, has launched small RNA sequencing (RNASeq) into more frequent use. However, known biases associated with small RNASeq, compounded by low RNA inputs, have been both a significant concern and a hurdle to widespread adoption. As RNASeq is becoming a viable choice for the discovery of small RNAs in low input samples and more labs are employing it, there should be benchmark datasets to test and evaluate the performance of new sequencing protocols and operators. In a recent publication from the National Institute of Standards and Technology, Pine et al., 2018, the investigators used a commercially available set of three tissues and tested performance across labs and platforms. RESULTS: In this paper, we further tested the performance of low RNA input in three commonly used and commercially available RNASeq library preparation kits; NEB Next, NEXTFlex, and TruSeq small RNA library preparation. We evaluated the performance of the kits at two different sites, using three different tissues (brain, liver, and placenta) with high (1 μg) and low RNA (10 ng) input from tissue samples, or 5.0, 3.0, 2.0, 1.0, 0.5, and 0.2 ml starting volumes of plasma. As there has been a lack of robust validation platforms for differentially expressed miRNAs, we also compared low input RNASeq data with their expression profiles on three different platforms (Abcam Fireplex, HTG EdgeSeq, and Qiagen miRNome). CONCLUSIONS: The concordance of RNASeq results on these three platforms was dependent on the RNA expression level; the higher the expression, the better the reproducibility. The results provide an extensive analysis of small RNASeq kit performance using low RNA input, and replication of these data on three downstream technologies.