レトロスペクティブ分析：2細胞段階のマウス胚におけるmRNA発現の芽惑星間違いの再現性は、芽球の多様化の組み合わせメカニズムのために著しく貧弱です

研究の質問: マウスの 2 細胞期胚の姉妹割球間のトランスクリプトームの違いの普及、再現性、生物学的意義は何ですか? 要約回答: 姉妹 2 細胞期割球は mRNA 分析によって互いに区別でき、分化は主にマウス胚の初期に始まるという事実を証明しています。ただし、割球間の差異は再現性が低く、割球多様化の既知および新しいメカニズムの組み合わせ効果を引き起こします。 すでにわかっていること: マウスの単一割球のトランスクリプトーム データセットは何年も前から利用可能でしたが、体系的にまとめて分析されたことはありませんでした。ただし、そのような分析により、哺乳類の初期発生に関する未解明のトピックが明らかになる可能性があります。残る 2 つの不明点は、どの段階で胚の割球が互いに多様化し始めるのか、その違いの分子的起源は何かということです。接合子後最も初期の段階である2細胞段階では、これらの質問に対する答えに関して意見が分かれています。1つのグループは、最初の接合子分裂によって完全な生物を形成できる2つの等しい割球が生成されます（全能性）と主張し、別のグループは、下等な分類群の胚に見られる前パターン形成を彷彿とさせる割球間差異の証拠があると主張しています。割球間差異の分子的起源に関しては、（1）卵母細胞異方性、（2）精子の進入点、（3）転写プールの分割エラー、および（4）2つの割球における非同期の胚ゲノム活性化を呼び出す4つの一般的なモデルがあります。研究デザイン、規模、期間：2011年から2017年の間に発表された7つのトランスクリプトーム研究は、マウスの2細胞胚の両方の割球が元のペアの関連性に関して個別に分析され、データセットがパブリックリポジトリで利用可能になったため、遡及的分析の対象となりました。これらの研究のうち、姉妹割球計 43 組を含む 5 件の研究が、mRNA レベルの高い割球間相関に基づいてさらに分析するために選択されました。胚内および胚間の両方で堅牢な割球間差異を持つ mRNA (ヒット) を選択するために、二重カットオフが使用されました。各研究のヒットは、ベン図を使用して他の研究のヒットと比較および対比されました。5 件の研究のうち少なくとも 4 件で共有されているヒットは、バイオインフォマティクスによってさらに分析されました。参加者/材料、設定、方法: 公開されているマイクロアレイ データセット (GEO、ArrayExpress) に加えて、PubMed で単一の 2 細胞期割球の mRNA 発現プロファイルを体系的に調べました。元の正規化に基づいて、7 件の研究のデータが遺伝子レベルでのペアワイズ サンプル相関についてスクリーニングされ (Spearman)、最も相関の高い上位 5 件のデータセットが階層的クラスター分析にかけられました。遺伝子発現の胚盤胞間差異は、各胚盤胞ペアの mRNA レベルの高い方と低い方の比率として表されました。胚盤胞間差異の判定には二重カットオフが使用され、ペアの少なくとも 50% で mRNA 比率が 2 を超える遺伝子が認められた場合にそれを採用し、その他の遺伝子は破棄しました。5 つのデータセットのうち少なくとも 4 つに共通する胚盤胞間差異の割合が計算されました。最後に、PANTHER および GORILLA プラットフォームを使用して、対応する遺伝子、パスウェイ、エンリッチメント解析が実行されました。主な結果と偶然の役割: データセット内の遺伝子の平均 17% は姉妹胚盤胞間で異なる発現を示しており、5 つの研究のうち少なくとも 4 つに共通する差異を考慮すると、その割合は 1% に低下します。ハウスキーピング mRNA は 17% および 1% の遺伝子リストに含まれていなかったため、胚盤胞間差異は単なる偶然では発生していないことが示唆されます。共有される胚盤胞間差異の 1% は 100 個の遺伝子から成り、そのうち 35 個は姉妹胚盤胞多様化の 4 つの一般的なモデルの少なくとも 1 つと一致しています。4 つのモデルと一致しない残りの 65 個の遺伝子のバイオインフォマティクス分析では、少なくとももう 1 つのメカニズムが作用しており、おそらく内膜系に関連していることが示唆されています。再現性の問題には多くの側面 (生物学的、実験的、分析的) がありますが、少なくとも 5 つの多様性のソースが互いに重なり合って、少なくとも 25 = 32 の異なる状態を占めるため、姉妹胚盤胞は mRNA レベルの高い胚盤胞間相関を回避できると考えています。その結果、特定の 2 細胞胚の胚盤胞間 mRNA の差異は、必然的に別の 2 細胞胚で再現するのが困難になります。大規模データ: データは元の研究 (GSE21688、GSE22182、GSE27396、GSE45719、GSE57249、E-MTAB-3321、GSE94050) で提供されたものです。制限事項、注意すべき理由: 元の研究では、類似点 (例: 卵巣刺激後の体内受精) と相違点 (例: マウスの系統、割球分離の方法とタイミング) が示されています。姉妹割球間では mRNA の差が顕著であることが確認されましたが、二重カットオフ法は閾値を使用しており、偽陰性よりも偽陽性に対して保護効果が高いため、これらの差は過小評価されています。偽陰性に関しては、トランスクリプトーム解析では、(1) 2 倍のカットオフでは、残りの分割割球間差異を検出できるほど感度が高くなかった、(2) トランスクリプトーム法の検出限界が十分ではなかった、(3) 転写変化が振動しているか、差異が非転写的または転写後に媒介されているため、分割割球間差異がトランスクリプトーム同定に気づかなかったなどの理由で、一部のみを捕捉した可能性がある。偽陽性に関しては、異なる研究室がデータを生成したことを考えると、同じ技術的エラーにより、同じ転写産物のグループで偶然差異が見つかったとは考えにくい。調査結果のより広範な意味: 姉妹分割球は、2 細胞段階であっても、mRNA 解析によって互いに区別できることは明らかであるが、大きな安定したパターンを特定する努力は無駄になる可能性がある。これは、既存のものに新しいトランスクリプトーム データセットを追加することの賢明さについて考えさせる。これまでに作成されたすべてのトランスクリプトミクスデータセットの再現性が 1% である場合、将来の研究ではおそらく同じ問題に再び直面することになります。おそらく、「存在するはずであるが見つからなかった大きな安定パターン」を確実に特定するには、ここで検討した 7 つのデータセットの合計よりもさらに大きなデータセットが必要です。逆に、小さな安定パターンは特定しやすいかもしれませんが、その生物学的関連性は明らかではありません。あるいは、細胞分裂期間の違いは核酸ではなく、他の細胞成分によって媒介されている可能性があります。研究資金/競合利益: この研究は、ドイツ研究振興協会 (MB への助成金 DFG BO 2540-4-3、VN への助成金 NO 413/3-3) の支援を受けました。著者は、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

STUDY QUESTION: What is the prevalence, reproducibility and biological significance of transcriptomic differences between sister blastomeres of the mouse 2-cell embryo? SUMMARY ANSWER: Sister 2-cell stage blastomeres are distinguishable from each other by mRNA analysis, attesting to the fact that differentiation starts mostly early in the mouse embryo; however, the interblastomere differences are poorly reproducible and invoke the combinatorial effects of known and new mechanisms of blastomere diversification. WHAT IS KNOWN ALREADY: Transcriptomic datasets for single blastomeres in mice have been available for years but have never been systematically analysed together, although such an analysis may shed light onto some unclarified topics of early mammalian development. Two unknowns that remain are at which stage embryonic blastomeres start to diversify from each other and what is the molecular origin of that difference. At the earliest postzygotic stage, the 2-cell stage, opinions differ regarding the answer to these questions; one group claims that the first zygotic division yields two equal blastomeres capable of forming a full organism (totipotency) and another group claims evidence for interblastomere differences reminiscent of the prepatterning found in embryos of lower taxa. Regarding the molecular origin of interblastomere differences, there are four prevalent models which invoke (1) oocyte anisotropy, (2) sperm entry point, (3) partition errors of the transcript pool and (4) asynchronous embryonic genome activation in the two blastomeres. STUDY DESIGN, SIZE, DURATION: Seven transcriptomic studies published between 2011 and 2017 were eligible for retrospective analysis, since both blastomeres of the mouse 2-cell embryo had been analysed individually regarding the original pair associations and since the datasets were made available in public repositories. Five of these studies, encompassing a total of 43 pairs of sister blastomeres, were selected for further analyses based on high interblastomere correlations of mRNA levels. A double cut-off was used to select mRNAs that had robust interblastomere differences both within and between embryos (hits). The hits of each study were compared and contrasted with the hits of the other studies using Venn diagrams. The hits shared by at least four of five studies were analysed further by bioinformatics. PARTICIPANTS/MATERIALS, SETTING, METHODS: PubMed was systematically examined for mRNA expression profiles of single 2-cell stage blastomeres in addition to publicly available microarray datasets (GEO, ArrayExpress). Based on the original normalizations, data from seven studies were screened for pairwise sample correlation at the gene level (Spearman), and the top five datasets with the highest correlation were subjected to hierarchical cluster analysis. Interblastomere differences of gene expression were expressed as a ratio of the higher to the lower mRNA level for each pair of blastomeres. A double cut-off was used to make the call of interblastomere difference, accepting genes with mRNA ratios above 2 when observed in at least 50% of the pairs, and discarding the other genes. The proportion of interblastomere differences common to at least four of the five datasets was calculated. Finally, the corresponding gene, pathway and enrichment analyses were performed utilizing PANTHER and GORILLA platforms. MAIN RESULTS AND THE ROLE OF CHANCE: An average of 17% of genes within the datasets are differently expressed between sister blastomeres, a proportion which falls to 1% when considering the differences that are common to at least four of the five studies. Housekeeping mRNAs were not included in the 17% and 1% gene lists, suggesting that the interblastomere differences do not occur simply by chance. The 1% of shared interblastomere differences comprise 100 genes, of which 35 are consistent with at least one of the four prevalent models of sister blastomere diversification. Bioinformatics analysis of the remaining 65 genes that are not consistent with the four models suggests that at least one more mechanism is at play, potentially related to the endomembrane system. Although there are many dimensions to the issue of reproducibility (biological, experimental, analytical), we consider that the sister blastomeres are poised to escape high interblastomere correlations of mRNA levels, because at least five sources of diversity superimpose on each other, accounting for at least 25 = 32 different states. As a result, interblastomere mRNA differences of a given 2-cell embryo are necessarily difficult to reproduce in another 2-cell embryo. LARGE SCALE DATA: Data were as provided by the original studies (GSE21688, GSE22182, GSE27396, GSE45719, GSE57249, E-MTAB-3321, GSE94050). LIMITATIONS, REASONS FOR CAUTION: The original studies present similarities (e.g. fertilization in vivo after ovarian stimulation) as well as differences (e.g. mouse strains, method and timing of blastomere separation). We identified robust mRNA differences between the sister blastomeres, but these differences are underestimated because our double cut-off method works with thresholds and affords more protection against false positives than false negatives. Regarding the false negatives, transcriptome analysis may have captured only part of the interblastomere differences due to: (1) the 2-fold cut-off not being sensitive enough to detect the remaining part of the interblastomere differences, (2) the detection limit of the transcriptomic methods not being sufficient, or (3) interblastomere differences being oblivious to transcriptomic identification because transcriptional changes are oscillatory or because differences are mediated non-transcriptionally or post-transcriptionally. Regarding the false positives, it seems unlikely that a difference was found just by chance for the same group of transcripts due to the same technical error, given that different laboratories produced the data. WIDER IMPLICATIONS OF THE FINDINGS: It is clear that the sister blastomeres are distinguishable from each other by mRNA analysis even at the 2-cell stage; however, efforts to identify large stable patterns may be in vain. This elicits thoughts about the wisdom of adding new transcriptomic datasets to the ones that already exist; if all transcriptomic datasets produced so far show a reproducibility of 1%, then any future study would probably face the same issue again. Possibly, a solid identification of the 'large stable pattern that should be there but was not found' requires an even larger dataset than the sum of the seven datasets considered here. Conversely, small stable patterns may be easier to identify, but their biological relevance is less obvious. Alternatively, interblastomere differences may not be mediated by nucleic acids but by other cellular components. STUDY FUNDING/COMPETING INTEREST(S): This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (grant DFG BO 2540-4-3 to M.B. and grant NO 413/3-3 to V.N.). The authors declare that they have no competing financial interests.