アデノシンA2B受容体を研究するためのツールとしてのトリチウム標識アゴニスト

現在、A2Bアデノシン受容体（A2BARS）の選択的アゴニスト放射性リガンドは利用できません。このようなツールは、受容体の活性な立体構造の標識に役立ちます。したがって、トリチウム標識の形で、強力で機能的に選択的なA2BAR（部分）アゴニストであるBay 60-6583を準備しました。しかし、広範な努力にもかかわらず、[3H] Bay 60-6583を使用して放射性リガンド結合アッセイを確立することはできませんでした。これはおそらく、その高い非固有の結合と、以前は機能データに基づいて過大評価されていた中程度の親和性によるものです。別の方法として、非選択的A2BARアゴニスト[3H] NECAをA2BARにラベル付けする可能性について評価しました。[3H] NECAは、中国のハムスター卵巣（CHO）またはヒト胚性腎臓（HEK）細胞の膜調製物への特異的、飽和、および可逆的な結合を示し、ヒト、ラット、またはマウスのA2BARを安定に発現させた。競合結合実験では、ARアゴニスト2-クロロアデノシン（CADO）とNECAは、A2B療法のラジオリガンドよりもテストされた場合、[3H] NECAに対して有意に高い親和性を示しました。Bay 60-6583はA2BARアゴニストですが、[3H] NECAよりも[3H] PSB-603に対してより高い親和性を示しました。これらの結果は、ヌクレオシドと非ヌクレオシドアゴニストがA2BARの非常に異なる立体構造に結合していることを示しています。結論として、[3H] NECAは現在、アクティブなA2BAR立体構造に対するリガンドの親和性を決定するための唯一の有用なラジオリガンドです。

A selective agonist radioligand for A2B adenosine receptors (A2BARs) is currently not available. Such a tool would be useful for labeling the active conformation of the receptors. Therefore, we prepared BAY 60-6583, a potent and functionally selective A2BAR (partial) agonist, in a tritium-labeled form. Despite extensive efforts, however, we have not been able to establish a radioligand binding assay using [3H]BAY 60-6583. This is probably due to its high non-specific binding and its moderate affinity, which had previously been overestimated based on functional data. As an alternative, we evaluated the non-selective A2BAR agonist [3H]NECA for its potential to label A2BARs. [3H]NECA showed specific, saturable, and reversible binding to membrane preparations of Chinese hamster ovary (CHO) or human embryonic kidney (HEK) cells stably expressing human, rat, or mouse A2BARs. In competition binding experiments, the AR agonists 2-chloroadenosine (CADO) and NECA displayed significantly higher affinity when tested versus [3H]NECA than versus the A2B-antagonist radioligand [3H]PSB-603 while structurally diverse AR antagonists showed the opposite effects. Although BAY 60-6583 is an A2BAR agonist, it displayed higher affinity versus [3H]PSB-603 than versus [3H]NECA. These results indicate that nucleoside and non-nucleoside agonists are binding to very different conformations of the A2BAR. In conclusion, [3H]NECA is currently the only useful radioligand for determining the affinity of ligands for an active A2BAR conformation.