チオレドキシンおよびHisタグタンパク質融合システムを使用した野生型HIV-1サブタイプCプロテアーゼと2つのバリアントの過剰発現、精製、および機能的特性評価

近年、抗レトロウイルス療法に不可欠な薬物標的であるため、HIV-1プロテアーゼを過剰発現および精製するためにさまざまな戦略が使用されています。しかし、十分な量の酵素を取得することは依然として困難です。酵素の自己分解性と大腸菌細胞におけるその固有の細胞毒性により、大量の過剰発現が防止されます。ここでは、野生型と2つのバリアントプロテアーゼのためのチオレドキシン - ヘキサヒスチジン融合システムを使用した新しいHIV-1プロテアーゼ精製法について説明します。融合プロテアーゼは大腸菌で過剰発現し、固定化された金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによって回収されました。プロテアーゼは、トロンビンを使用して融合構築物から切断されました。私たちの研究室で使用されている標準的な過剰発現および精製プロトコルと比較した場合、融合由来の野生型プロテアーゼの発現は、培養培地の0.83から2.5 mg/Lに増加しました。2つのバリアントプロテアーゼの発現レベルは、培地の1.5〜2 mg/Lの範囲でした。酵素活性が観察されなかったため、融合野生型およびバリアントプロテアーゼは、チオレドキシン - ヘキサヒスチジン融合タグの切断の前に不活性でした。しかし、プロテアーゼは、タグの切断後に活動していました。したがって、新規のチオレドキシン - ヘキサヒスチジン融合システムは、触媒的に活性なHIV-1プロテアーゼの過剰発現と精製を成功させることができます。

In recent years, various strategies have been used to overexpress and purify HIV-1 protease because it is an essential drug target in anti-retroviral therapy. Obtaining sufficient quantities of the enzyme, however, remains challenging. Overexpression of large quantities is prevented due to the enzyme's autolytic nature and its inherent cytotoxicity in Escherichia coli cells. Here, we describe a novel HIV-1 protease purification method using a thioredoxin-hexahistidine fusion system for the wild-type and two variant proteases. The fusion proteases were overexpressed in E. coli and recovered by immobilised metal ion affinity chromatography. The proteases were cleaved from the fusion constructs using thrombin. When compared to the standard overexpression and purification protocol in use in our laboratory, the expression of the fusion-derived wild-type protease was increased from 0.83 to 2.5 mg/l of culture medium. The expression levels of the two variant proteases ranged from 1.5 to 2 mg/l of culture medium. The fusion wild-type and variant proteases were inactive before the cleavage of the thioredoxin-hexahistidine fusion tag as no enzymatic activity was observed. The proteases were, however, active after cleavage of the tag. The novel thioredoxin-hexahistidine fusion system, therefore, enables the successful overexpression and purification of catalytically active HIV-1 proteases.