ラット肝臓からのシトクロムCオキシダーゼの分離と特性と、サブユニット特異的抗血清を持つさまざまなラット組織からのアイソザイム間の免疫学的差異の定量化

シトクロムCオキシダーゼは、シトクロム-C-セファロース4Bのアフィニティクロマトグラフィー、またはDEAE-セファロースのクロマトグラフィーのいずれかにより、ラット肝臓から分離されました。両方の製剤のドデシル硫酸ゲル電気泳動は、13種類のポリペプチドで構成される同じサブユニットパターンを示しました。2つの製剤の速度論的分析により、DEAE-Sephacelのクロマトグラフィーによって分離された酵素に対してより高いVmaxが得られました。特定の抗血清は、10個の核内胚葉サブユニットのうち9個に対してウサギで育てられました。各抗血清とその対応するサブユニットの単一特異的反応は、ウエスタンブロット分析によって得られたため、タンパク質分解、凝集またはサブユニットの調整修飾による分離酵素のゲル電気泳動パターンの人工帯は除外されました。ラット肝臓のホロシトクロムCオキシダーゼに対する抗血清により、豚の肝臓または腎臓および心臓または骨格筋からの分離シトクロムCオキシダーゼを介したサブユニットとVIIIのウエスタンブロット分析により、異なる反応性が発見されました。免疫学的違いの定量的分析のために、ニトロセルロース酵素結合免疫吸着アッセイが開発されました。ラット肝臓シトクロムCオキシダーゼの13サブユニットのうち12サブユニットのうち12に対する単一特異的抗血清を、硫酸ドデシルに溶解し、ニトロセルロースに点留めた異なるラット組織からの総ミトコンドリアタンパク質の量が増加して滴定されました。2番目のペルオキシダーゼ結合抗体によって発生した可溶性色素の吸光度を測定しました。データから、次の結論が得られました。（a）シトクロムCオキシダーゼのミトコンドリアをコードした触媒サブユニットI-IIIは、おそらくすべてのラット組織で同一です。（b）シトクロムCオキシダーゼの9つの調査対象核エンコードサブユニットは、2つ以上の組織間に免疫学的違いを示しました。肝臓、腎臓、脳、心臓または骨格筋の間に大きな免疫学的な違いが見つかりました。心臓と骨格筋の間のいくつかのサブユニット、および肝臓、腎臓、脳の間のいくつかのサブユニットでは、軽微であるが有意な違いが観察されました。（c）肝臓、心臓および骨格筋の胎児および成体組織からのシトクロムCオキシダーゼの対応する核コードされたサブユニットの間、見かけの免疫学的違いが観察されました。データは、シトクロムCオキシダーゼ欠乏による致命的な乳児ミオパシーの症例を説明することができます。

Cytochrome c oxidase was isolated from rat liver either by affinity chromatography on cytochrome-c--Sepharose 4B or by chromatography on DEAE-Sepharose. Dodecyl sulfate gel electrophoresis of both preparations showed the same subunit pattern consisting of 13 different polypeptides. Kinetic analysis of the two preparations gave a higher Vmax for the enzyme isolated by chromatography on DEAE-Sephacel. Specific antisera were raised in rabbits against nine of the ten nuclear endoded subunits. A monospecific reaction of each antiserum with its corresponding subunit was obtained by Western blot analysis, thus excluding artificial bands in the gel electrophoretic pattern of the isolated enzyme due to proteolysis, aggregation or conformational modification of subunits. With an antiserum against rat liver holocytochrome c oxidase a different reactivity was found by Western blot analysis for subunits VIa and VIII between isolated cytochrome c oxidases from pig liver or kidney and heart or skeletal muscle. For a quantitative analysis of immunological differences a nitrocellulose enzyme-linked immunosorbent assay was developed. Monospecific antisera against 12 of the 13 subunits of rat liver cytochrome c oxidase were titrated with increasing amounts of total mitochondrial proteins from different rat tissues dissolved in dodecyl sulfate and dotted on nitrocellulose. The absorbance of a soluble dye developed by the second peroxidase-conjugated antibody was measured. From the data the following conclusions were obtained: (a) The mitochondrial encoded catalytic subunits I-III of cytochrome c oxidase are probably identical in all rat tissues. (b) All nine investigated nuclear encoded subunits of cytochrome c oxidase showed immunological differences between two or more tissues. Large immunological differences were found between liver, kidney or brain and heart or skeletal muscle. Minor but significant differences were observed for some subunits between heart and skeletal muscle and between liver, kidney and brain. (c) Between corresponding nuclear encoded subunits of cytochrome c oxidase from fetal and adult tissues of liver, heart and skeletal muscle apparent immunological differences were observed. The data could explain cases of fatal infantile myopathy due to cytochrome c oxidase deficiency.