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シアノバクテリア（青緑色の藻類）であるAnacystis nidulansのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（PPC）は、大腸菌でクローニングされました。A. nidulansの染色体DNAをSAU3AIで部分的に消化し、得られたDNA断片をPBR322のBAMHI部位で連結しました。ハイブリッドプラスミドを最初に大腸菌K802（HSDR-、HSDM+）に変換して、A。nidulansの遺伝子バンクを取得しました。銀行は約12,000のクローンで構成されていました。次に、これらのハイブリッドプラスミドを大腸菌PCR1（PPC2-、RECA1-、HSDR+、HSDM+）に変換し、PPC変異の補完（グルタミン酸要件の表現型）の補完により形質転換体を選択しました。クローン化されたPPC遺伝子を有する大腸菌株の無細胞抽出物では、ペプケース活性が検出されましたが、それらの特性は大腸菌酵素の特性とは異なりました。サブクローニングによる分析により、PPC遺伝子は長さ3,500塩基対のDNAフラグメントに含まれており、Maxicell法は遺伝子産物の分子量が約108,000であることが明らかになりました。PPC遺伝子は、主に読み取りスルー転写によって大腸菌で発現することが示唆されており、PBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターによって開始されますが、クローン化されたPPC遺伝子の逆方向の有意な発現は、遺伝子が含まれることを示しています。大腸菌細胞で機能できるプロモーター。
シアノバクテリア（青緑色の藻類）であるAnacystis nidulansのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（PPC）は、大腸菌でクローニングされました。A. nidulansの染色体DNAをSAU3AIで部分的に消化し、得られたDNA断片をPBR322のBAMHI部位で連結しました。ハイブリッドプラスミドを最初に大腸菌K802（HSDR-、HSDM+）に変換して、A。nidulansの遺伝子バンクを取得しました。銀行は約12,000のクローンで構成されていました。次に、これらのハイブリッドプラスミドを大腸菌PCR1（PPC2-、RECA1-、HSDR+、HSDM+）に変換し、PPC変異の補完（グルタミン酸要件の表現型）の補完により形質転換体を選択しました。クローン化されたPPC遺伝子を有する大腸菌株の無細胞抽出物では、ペプケース活性が検出されましたが、それらの特性は大腸菌酵素の特性とは異なりました。サブクローニングによる分析により、PPC遺伝子は長さ3,500塩基対のDNAフラグメントに含まれており、Maxicell法は遺伝子産物の分子量が約108,000であることが明らかになりました。PPC遺伝子は、主に読み取りスルー転写によって大腸菌で発現することが示唆されており、PBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターによって開始されますが、クローン化されたPPC遺伝子の逆方向の有意な発現は、遺伝子が含まれることを示しています。大腸菌細胞で機能できるプロモーター。
The phosphoenolpyruvate carboxylase gene (ppc) from Anacystis nidulans, a cyanobacterium (blue-green alga), was cloned in Escherichia coli. Chromosomal DNA of A. nidulans was partially digested with Sau3AI, and the obtained DNA fragments were ligated in the BamHI site of pBR322. The hybrid plasmids were first transformed into E. coli K802 (hsdR-, hsdM+) to obtain the gene bank of A. nidulans. The bank consisted of about 12,000 clones. These hybrid plasmids were then transformed into E. coli PCR1 (ppc2-, recA1-, hsdR+, hsdM+), and the transformants were selected by complementation of the ppc mutation (phenotype of glutamate requirement). In the cell-free extracts of E. coli strains having the cloned ppc gene, PEPCase activities were detected, but their properties were different from those of the E. coli enzyme. Analysis by subcloning showed that the ppc gene was included in a DNA fragment 3,500 base pairs long and the maxicell method revealed that the molecular weight of the gene product was about 108,000. It is suggested that the ppc gene is expressed in E. coli mainly by read-through transcription, being initiated by the promoter of tetracycline-resistance gene of pBR322, but the significant expression in reversed orientation of the cloned ppc gene indicates that the gene includes a promoter capable of functioning in E. coli cells.
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