in vitroでのラムダDV DNA複製の起源と開始部位

複製のユニークな開始に不可欠なラムダDNAの配列は、in vitro複製システムで分析されました。ラムダDNAの断片をPBR322に挿入し、テンプレートとして使用するか、PBR322の非存在下でin vitroで循環し、同じテストで採用しました。ラムダゲノムのO遺伝子にあるECORI部位の165 bp領域の左は、機能起源として定義されました。Ori領域として定義したこの領域は、Oタンパク質が結合する（Ori-Repeats）、A+Tが豊富なストレッチ、およびAの一部を構成する領域である4つの19 bpリピートシーケンスを順番に運びます。大きなパリンドローム構造。Lambda DNA複製の開始に関与すると長い間疑われてきた領域は、P依存性ラムダ特異的複製開始には必要ありませんでした。Lambda DVと「Ori領域Plus」組換えプラスミドは、この領域またはその周辺でDNA合成を開始し、反応はLambdaコードされた開始因子OおよびPタンパク質の存在に依存していました。Lambda DVの初期の複製中間体は、DNA鎖伸長の阻害剤であるDDCTPの存在下でin vitro複製システムで調製されました。このシステムは、複製開始の結果であるDNA合成のみを許可します。このシステムを使用して、DNA合成の開始部位は、プライマーRNAからDNA合成への遷移部位をマッピングすることにより、細かく分析されました。ORI地域の近くの地域から生成された短鎖DNAは、中間体から精製されました。短鎖DNAの一部は、プライマーRNAに共有結合してリンクされていました。RNA（遷移部位）にリンクされていた5'Endsは、32pで標識されたアルカリ加水分解によって露出し、遷移部位はゲノムのヌクレオチド配列に沿ってマッピングされました。この分析から2つの印象的な特徴が明らかになりました。（i）遷移サイトはORI地域の両側にあり、165 bpのORI地域内に遷移は発生しません。（ii）両側の遷移部位は一意ではなく、複数であり、2つのストランドの1つにクラスター化されています。さらに、それらの方向は、ORI領域の2つの側面からの複製の開始におけるDNA合成が収束することを示しています。「左側」のDNA合成の頻度は、「右側」合成の周波数よりも数倍高くなっています。これらの結果は、ラムダDV DNAの非対称双方向の複製を反映しており、ラムダファージDNAの複製も反映する可能性があります。

The sequence of lambda DNA essential for the unique initiation of replication was analyzed in an in vitro replication system. Fragments of lambda DNA were inserted into pBR322 and used as templates or were circularized in vitro in the absence of pBR322 and employed in the same tests. A 165-bp region left of the EcoRI site in the O gene of the lambda genome was defined as the functional origin. This region, which we defined as the ori region, carries, in order, the 4 19-bp repeat sequences where the O protein binds (ori-repeats), an A+T-rich stretch, and a region that constitutes part of a large palindromic structure. Regions that have long been suspected to participate in lambda DNA replication initiation, ice and oop were not required for the O, P-dependent lambda-specific replication initiation. The lambda dv and the "ori region plus" recombinant plasmids initiated DNA synthesis at or around this region, and the reaction depended on the presence of lambda-coded initiators, O and P proteins. Early replicative intermediates of lambda dv were prepared in an in vitro replication system in the presence of ddCTP, an inhibitor of DNA chain elongation. This system allows only that DNA synthesis that is a result of replication initiation. Using this system, the initiation site(s) of the DNA synthesis was finely analyzed by mapping the transition sites from primer RNA to DNA synthesis. Short-chain DNAs produced from regions near the ori region were purified from the intermediates. A fraction of the short-chain DNAs was covalently linked to primer RNA. The 5'-ends that had been linked to RNA (transition sites) were exposed by alkaline hydrolysis, labeled with 32P, and the transition sites were mapped along the nucleotide sequence of the genome. Two striking features emerged from this analysis: (i) The transition sites are located on both sides of the ori region, and no transition arose within the 165-bp ori region; (ii) The transition sites on both sides are not unique, but multiple, and are clustered in one of the 2 strands. Furthermore, their orientation demonstrates that the DNA synthesis in initiation of replication from the 2 sides of the ori region converge. The frequency of the "leftward" DNA synthesis is several times higher than that of "rightward" synthesis. These results reflect asymmetric bidirectional replication of lambda dv DNA, and may also reflect replication of lambda phage DNA.