プラスミドのコピー数調節に依存しないCole1プラスミドの安定性の遺伝的制御

Cole1様プラスミドベクターは、大腸菌の組換え遺伝子の発現に広く使用されています。これらのベクターの場合、細胞分裂中の個々のプラスミドの娘細胞への分離はランダムであるように思われ、メンテナンスが存在することを保証するメカニズムがない場合、時間の経過とともに損失を受けやすくなります。ここでは、組換え遺伝子発現の文脈におけるプラスミドの安定性に影響を与える研究因子を研究するために、感作モデルとしてRECA Rela株でプラスミドPGFPUVを使用します。このモデルでは、プラスミドの安定性は、複製（ORI）配列のプラスミド起源に対する2種類の遺伝的修飾によって回復できることがわかります。Das（重複した抗sense）ori。これらの変更の組み合わせにより、さまざまなコピー数と組換え発現のレベルが生成されます。古典的なランダム分布モデルと直接矛盾している場合、プラスミドコピー数の増加とプラスミドの安定性の増加との間に相関関係はありません。組換え遺伝子発現のレベルの低下によっても、安定性の増加は説明できません。私たちの観察結果は、超解像蛍光顕微鏡を使用したin vivoでの個々のプラスミドの検出に基づいて最近提案されたハイブリッドクラスター化およびフリーディスストリビューションモデルとより互換性があります。この研究は、複製開始とは異なるCoLE1プラスミドの分離の制御におけるプラスミドORIの役割を示唆しており、大規模な組換え遺伝子発現またはバイオメディエーションの強化を目的とした戦略としてプラスミドの安定性の遺伝的調節のドアを開きます。

ColE1-like plasmid vectors are widely used for expression of recombinant genes in E. coli. For these vectors, segregation of individual plasmids into daughter cells during cell division appears to be random, making them susceptible to loss over time when no mechanisms ensuring their maintenance are present. Here we use the plasmid pGFPuv in a recA relA strain as a sensitized model to study factors affecting plasmid stability in the context of recombinant gene expression. We find that in this model, plasmid stability can be restored by two types of genetic modifications to the plasmid origin of replication (ori) sequence: point mutations and a novel 269 nt duplication at the 5' end of the plasmid ori, which we named DAS (duplicated anti-sense) ori. Combinations of these modifications produce a range of copy numbers and of levels of recombinant expression. In direct contradiction with the classic random distribution model, we find no correlation between increased plasmid copy number and increased plasmid stability. Increased stability cannot be explained by reduced levels of recombinant gene expression either. Our observations would be more compatible with a hybrid clustered and free-distribution model, which has been recently proposed based on detection of individual plasmids in vivo using super-resolution fluorescence microscopy. This work suggests a role for the plasmid ori in the control of segregation of ColE1 plasmids that is distinct from replication initiation, opening the door for the genetic regulation of plasmid stability as a strategy aimed at enhancing large-scale recombinant gene expression or bioremediation.