非還元SDS-PAGEによって検出されたIgGドメインの展開

モノクローナル抗体は、現代の治療において非常に重要であり、新たに承認された薬物のかなりの割合を構成しています。すべての治療的モノクローナル抗体は、構造的および機能的完全性について分析する必要があり、すべてのタンパク質の不均一性を特定して定量化する必要があります。モノクローナル抗体の立体構造の安定性も、抗体保存と取り扱いの安定性に重要です。使用されている構造解析手法の最初で最も単純なものの1つはSDS-PAGEであり、これは、ジスルフィド結合を破壊するために事前の削減の有無にかかわらず実行できます。これにより、減少した状態での重い鎖と軽鎖の両方のサイジング、および非還元状態での無傷の抗体と任意のジスルフィド凝集体のサイジングが可能になります。ヒト抗コカインモノクローナル抗体を分析して、非還元SDS-PAGEを使用して、予想外に大きい見かけの分子量と見かけのタンパク質サイズの不均一性があることに気付きました。これらの見かけの分子量の不均一性は、他の分析手法と一致していません。不均一性は、いくつかの加熱および前エレクトロクロリエティックサンプル調製プロトコルを使用して認められ、プロパノールやブタノールなどの特定のアルコールを含むことにより修正されます。これらの予期しない結果はすべて、市販のヒトIgG1抗体についても観察され、これらの観察結果は一般にIgGに適用できることを示唆しています。したがって、IgGSの非還元SDS-PAGE結果の解釈には慎重に注意する必要があります。SDSのIGGSのFAB、CH2、およびCH3ドメインの微分熱展開は、SDS-PAGEを還元する前に異なる加熱プロトコルを使用して観察される安定した離散バンドを生じさせると仮定されています。

Monoclonal antibodies are very important in modern therapeutics and constitute a substantial percentage of newly approved drugs. Every therapeutic monoclonal antibody must be analyzed for structural and functional integrity, and all protein heterogeneities need to be identified and quantified. The conformational stabilities of the monoclonal antibodies are also important for antibody storage and handling stabilities. One of the first and simplest of the structural analysis techniques utilized is SDS-PAGE, which can be performed both with and without prior reduction to break disulfide bonds. This permits sizing of both heavy and light chains in the reduced condition, and sizing of the intact antibody and any disulfide aggregates in the non-reduced condition. Analyzing our human anti-cocaine monoclonal antibody, we noted unexpectedly larger apparent molecular weights and apparent protein size heterogeneities using non-reducing SDS-PAGE. These apparent molecular weight heterogeneities are not consistent with other analysis techniques. Heterogeneities were noted using several heating and pre-electrophoretic sample preparation protocols, and are modified by the inclusion of small concentrations of certain alcohols such as propanol and butanol. All of these unexpected results were also observed for a commercial human IgG1 antibody, suggesting that these observations are applicable to IgGs in general. Thus, careful attention must be paid to the interpretation of non-reducing SDS-PAGE results for IgGs. It is hypothesized that differential thermal unfolding of the Fab, CH2 and CH3 domains of the IgGs in SDS give rise to the stable, discrete bands observed using different heating protocols prior to non-reducing SDS-PAGE.