膜貫通ドメインは、エプスタインバーウイルス潜在膜タンパク質1の細胞内および細胞外輸送を媒介します1

EBV潜在膜タンパク質1（LMP1）は、小膜密閉細胞外小胞（EV）で潜在的に感染した腫瘍細胞から放出されます。蓄積された証拠は、LMP1がEV含有量と機能の主要な要因であることを示唆しています。LMP1修飾EVは、免疫細胞機能のレシピエント細胞の成長、移動、分化、および調節に影響を与えることが示されています。LMP1修飾エキソソームの重要性にもかかわらず、このウイルスタンパク質がどのように宿主EV経路に入るか操作するかについてはほとんど知られていません。この研究では、EV輸送に必要なタンパク質領域を評価するために、LMP1欠失変異体が生成されました。LMP1または変異体プラスミドのトランスフェクション後、EVは差次的遠心分離によって収集され、特定の貨物のレベルは免疫ブロット分析によって評価されました。結果は、LMP1のN末端と膜貫通領域1がEVへの効率的な並べ替えに十分であることを実証しています。これらの発見と一致して、N末端および膜貫通ドメイン1から4（TM5-6）を欠く変異体はEVにパッケージ化できず、野生型タンパク質よりも小胞体および初期エンドソームマーカーとのより高い共局在を示しました。驚くべきことに、TM5-6は、LMP1をEVに組み込むために重要な豊富なエキソソームタンパク質であるCD63と共局在し、複合体を形成する能力を維持しました。LMP1内の他の変異は、分泌のレベルが向上し、LMP1の細胞外小胞ソーティングの潜在的な陽性および陰性の調節メカニズムを指し示しました。これらのデータは、LMP1および細胞外輸送のN末端および膜貫通ドメインの新しい機能を示唆しています。これは、CD63との相互作用の下流である可能性が高いことを示唆しています。免疫不全または遺伝的に感受性のある個人における移植後リンパ腫。LMP1は、これらの癌でEBVによって発現する重要なウイルスタンパク質です。LMP1は細胞外小胞（EV）に分泌され、LMP1修飾EVの感染していない細胞への移動により、生理学が変化する可能性があります。LMP1修飾EVの重要性にもかかわらず、LMP1をEVに分類する責任のある細胞機械を理解することは限られています。ここでは、EVパッケージにおけるLMP1のさまざまな領域の役割を説明します。我々の結果は、N末端とTM1がLMP1 EV輸送を促進するのに十分であることを示しています。さらに、LMP1小胞ソーティングの潜在的な陽性および陰性の調節メカニズムの存在を示します。これらの調査結果は、EVへのLMP1ターゲティングのメカニズムを特定するための将来の調査のより良い基盤を提供します。

EBV latent membrane protein 1 (LMP1) is released from latently infected tumor cells in small membrane-enclosed extracellular vesicles (EVs). Accumulating evidence suggests that LMP1 is a major driver of EV content and functions. LMP1-modified EVs have been shown to influence recipient cell growth, migration, differentiation, and regulation of immune cell function. Despite the significance of LMP1-modified exosomes, very little is known about how this viral protein enters or manipulates the host EV pathway. In this study, LMP1 deletion mutants were generated to assess protein regions required for EV trafficking. Following transfection of LMP1 or mutant plasmids, EVs were collected by differential centrifugation, and the levels of specific cargo were evaluated by immunoblot analysis. The results demonstrate that, together, the N terminus and transmembrane region 1 of LMP1 are sufficient for efficient sorting into EVs. Consistent with these findings, a mutant lacking the N terminus and transmembrane domains 1 through 4 (TM5-6) failed to be packaged into EVs, and exhibited higher colocalization with endoplasmic reticulum and early endosome markers than the wild-type protein. Surprisingly, TM5-6 maintained the ability to colocalize and form a complex with CD63, an abundant exosome protein that is important for the incorporation of LMP1 into EVs. Other mutations within LMP1 resulted in enhanced levels of secretion, pointing to potential positive and negative regulatory mechanisms for extracellular vesicle sorting of LMP1. These data suggest new functions of the N terminus and transmembrane domains in LMP1 intra- and extracellular trafficking that are likely downstream of an interaction with CD63.IMPORTANCE EBV infection contributes to the development of cancers, such as nasopharyngeal carcinoma, Burkitt lymphoma, Hodgkin's disease, and posttransplant lymphomas, in immunocompromised or genetically susceptible individuals. LMP1 is an important viral protein expressed by EBV in these cancers. LMP1 is secreted in extracellular vesicles (EVs), and the transfer of LMP1-modified EVs to uninfected cells can alter their physiology. Understanding the cellular machinery responsible for sorting LMP1 into EVs is limited, despite the importance of LMP1-modified EVs. Here, we illustrate the roles of different regions of LMP1 in EV packaging. Our results show that the N terminus and TM1 are sufficient to drive LMP1 EV trafficking. We further show the existence of potential positive and negative regulatory mechanisms for LMP1 vesicle sorting. These findings provide a better basis for future investigations to identify the mechanisms of LMP1 targeting to EVs, which could have broad implications in understanding EV cargo sorting.