cryo-emグリッドの氷の厚さの日常的な決定

計装と自動化の最近の進歩により、Cryo-EMは、さまざまなタンパク質と複合体のほぼ原子解像度構造を生成するための一般的な方法になりました。サンプルの準備は、高品質のデータを収集する際の制限要因です。粒子が埋め込まれている硝子体氷の厚さは、最高品質のデータを収集するために最適化する必要がある多くの変数の1つです。ここでは、エネルギーフィルターまたは目的口の外側の散乱のいずれかを使用して、収集される潜在的なすべての画像の氷の厚さを測定する2つの方法を提示します。幾何学的または断層撮影方法とは異なり、これらは、データ収集を中断または大幅に減速させることなく、単一の粒子収集ワークフローに直接実装できます。テストケースの例とともに、レゴン/アピオンデータ収集ワークフローに実装されている方法について説明します。氷の厚さの日常的な監視は、サンプルの準備、データ収集、およびデータ処理を最適化するのに役立つはずです。

Recent advances in instrumentation and automation have made cryo-EM a popular method for producing near-atomic resolution structures of a variety of proteins and complexes. Sample preparation is still a limiting factor in collecting high quality data. Thickness of the vitreous ice in which the particles are embedded is one of the many variables that need to be optimized for collection of the highest quality data. Here we present two methods, using either an energy filter or scattering outside the objective aperture, to measure ice thickness for potentially every image collected. Unlike geometrical or tomographic methods, these can be implemented directly in the single particle collection workflow without interrupting or significantly slowing down data collection. We describe the methods as implemented into the Leginon/Appion data collection workflow, along with some examples from test cases. Routine monitoring of ice thickness should prove helpful for optimizing sample preparation, data collection, and data processing.