PNPaseノックアウトはmtDNA損失と変化した代謝遺伝子発現プログラムをもたらします

ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）は、複数の生物学的プロセスとヒト障害に関与する必須ミトコンドリア局在エキソリボヌクレアーゼです。ミトコンドリアにおけるPNPaseの役割を明らかにするために、最初に培養条件をシフトすることにより、PNPaseノックアウト（PKO）システムを確立して、呼吸の欠陥で細胞の成長を可能にしました。興味深いことに、マウス胚性線維芽細胞（MEF）で確立されたPKOは、ミトコンドリアDNA（mtDNA）の喪失をもたらしました。PKO細胞の転写プロファイルは、コレステロール（FDR = 6.35 x 10-13）、脂質（FDR = 3.21 x 10-11）、および二次アルコール（FDR = 1.04x10-12）で摂動を伴うRho0 mtDNA削除細胞に類似していました。野生型の親（TM6）MEFと比較した代謝経路遺伝子発現。トランスクリプトーム分析は、軸索形成（FDR = 4.49 x 10-3）、軸索の発達（FDR = 4.74 x 10-3）、および軸索ガイダンス（FDR = 4.74 x 10-3）に関連するプロセスを示しています。ヒトの髄鞘形成の遅延、難聴、脳腫症、および絨毛網膜欠損における原因となったPNPase変異を詳述する研究。過剰表現分析により、PKO細胞とRho0細胞の両方の代謝経路の変化が明らかになりました。したがって、細胞周期の進行と総代謝に関係する遺伝子の相関を評価し、TM6 MEFと比較してPKO細胞とRho0 MEFの間に強い正の相関が観察されました。PKOクローンの正規化されたバイオマス蓄積率を1時間あたり1.7％（SD±2.0％）および2.4％（SD±1.6％）で定量化しました。さらに、マウスの内耳有毛細胞のPKOは、以前はPNPaseの変異に関連していた人間の家族性聴覚障害に匹敵する進行性の難聴を引き起こしました。組み合わせて、我々の研究では、ミトコンドリアヌクレアーゼのノックアウトがmtDNA喪失をもたらすと報告し、mtDNAの維持がPNPaseについて報告された多数の生物学的活性に統一された接続を提供できることを示唆しています。

Polynucleotide phosphorylase (PNPase) is an essential mitochondria-localized exoribonuclease implicated in multiple biological processes and human disorders. To reveal role(s) for PNPase in mitochondria, we established PNPase knockout (PKO) systems by first shifting culture conditions to enable cell growth with defective respiration. Interestingly, PKO established in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) resulted in the loss of mitochondrial DNA (mtDNA). The transcriptional profile of PKO cells was similar to rho0 mtDNA deleted cells, with perturbations in cholesterol (FDR = 6.35 x 10-13), lipid (FDR = 3.21 x 10-11), and secondary alcohol (FDR = 1.04x10-12) metabolic pathway gene expression compared to wild type parental (TM6) MEFs. Transcriptome analysis indicates processes related to axonogenesis (FDR = 4.49 x 10-3), axon development (FDR = 4.74 x 10-3), and axonal guidance (FDR = 4.74 x 10-3) were overrepresented in PKO cells, consistent with previous studies detailing causative PNPase mutations in delayed myelination, hearing loss, encephalomyopathy, and chorioretinal defects in humans. Overrepresentation analysis revealed alterations in metabolic pathways in both PKO and rho0 cells. Therefore, we assessed the correlation of genes implicated in cell cycle progression and total metabolism and observed a strong positive correlation between PKO cells and rho0 MEFs compared to TM6 MEFs. We quantified the normalized biomass accumulation rate of PKO clones at 1.7% (SD ± 2.0%) and 2.4% (SD ± 1.6%) per hour, which was lower than TM6 cells at 3.3% (SD ± 3.5%) per hour. Furthermore, PKO in mouse inner ear hair cells caused progressive hearing loss that parallels human familial hearing loss previously linked to mutations in PNPase. Combined, our study reports that knockout of a mitochondrial nuclease results in mtDNA loss and suggests that mtDNA maintenance could provide a unifying connection for the large number of biological activities reported for PNPase.