効率的なクロスリンク識別を備えたMSクロスリンカーDSBUを使用した架橋質量分析のための簡略化されたプロトコル

質量分析（MS）と組み合わせた化学架橋は、タンパク質間相互作用を識別およびマッピングする強力なアプローチです。そのアプリケーションは、3次元構造の計算モデリングをサポートし、X線結晶学、NMR分光法、電子顕微鏡（EM）などの古典的な構造的方法論を補完します。多数の架橋剤、MSメソッド、およびデータ分析プログラムが開発されていますが、方法論的複雑さのために、現在、特殊な質量分析法のために予約されています。ここでは、単純化されたシングルステップ精製プロトコルを提示し、架橋ペプチドの識別が改善されます。私たちは、MS閉鎖架橋装置のDSBU（disuccinimidyl dibutyricurea）、Q拡張性質量分析計、およびデータ分析のための専用ソフトウェアMeroxを構造生物学にアクセスできるようにするための専用ソフトウェアMeroxを組み合わせた、フォローのパイプラインについて説明します。および生化学研究所。4-10サブユニット（いわゆるKMNネットワーク）、ワンステップペプチド精製、サイズ排除クロマトグラフィーによる濃縮を含むキネトコアサブコンプレックスに焦点を当てた実験では、135-28の非冗長架橋（577-820クロスリンクの同定が得られました。各実験からのリンクされたペプチド）。特に、特定された非冗長なクロスリンクの半分は、リジン - リジンの架橋ではなく、ヒドロキシ基を持つ関与したサイドチェーンでした。新しいパイプラインは、同位体標識架橋剤に基づいた以前に使用されていたパイプラインとして、タンパク質間相互作用の同定に匹敵する可能性があります。新しく特定されたクロスリンクにより、KMNの3Dモデルを改善し、低解像度EMマップの評価のための架橋データの力を強調することができました。要するに、最適化された実験スキームは、信頼できるクロスリンクデータセットを取得するための実行可能なショートカットを表しています。

Chemical cross-linking combined with mass spectrometry (MS) is a powerful approach to identify and map protein-protein interactions. Its applications support computational modeling of three-dimensional structures and complement classical structural methodologies such as X-ray crystallography, NMR spectroscopy, and electron microscopy (EM). A plethora of cross-linkers, MS methods, and data analysis programs have been developed, but due to their methodological complexity application is currently reserved for specialized mass spectrometry laboratories. Here, we present a simplified single-step purification protocol that results in improved identifications of cross-linked peptides. We describe an easy-to-follow pipeline that combines the MS-cleavable cross-linker DSBU (disuccinimidyl dibutyric urea), a Q-Exactive mass spectrometer, and the dedicated software MeroX for data analysis to make cross-linking MS accessible to structural biology and biochemistry laboratories. In experiments focusing on kinetochore subcomplexes containing 4-10 subunits (so-called KMN network), one-step peptide purification, and enrichment by size-exclusion chromatography yielded identification of 135-228 non-redundant cross-links (577-820 cross-linked peptides) from each experiment. Notably, half of the non-redundant cross-links identified were not lysine-lysine cross-links and involved side chains with hydroxy groups. The new pipeline has a comparable potential toward the identification of protein-protein interactions as previously used pipelines based on isotope-labeled cross-linkers. A newly identified cross-link enabled us to improve our 3D-model of the KMN, emphasizing the power of cross-linking data for evaluation of low-resolution EM maps. In sum, our optimized experimental scheme represents a viable shortcut toward obtaining reliable cross-link data sets.