低酸素条件下で培養された細胞からの内因性核タンパク質を使用した共免疫沈降アッセイ

低酸素レベル（低酸素）は、マスターレギュレーターとして機能する低酸素誘導因子1（HIF-1）複合体を使用して、さまざまな適応反応を引き起こします。HIF-1は、ヘテロダイマー酸素調節αサブユニット（HIF-1α）で構成され、血管新生、エリスポージス、glycolylyを含む多様なプロセスに関与するアリール炭化水素受容体核トランスロケーター（ARNT）としても知られるβサブユニット（HIF-1β）を構成的に発現しました。HIF-1相互作用タンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達経路の理解の鍵です。HIF-1αの安定性の調節に加えて、低酸素症はまた、HIF-1αやARNTを含む多くの転写因子の核移行を引き起こします。特に、このようなタンパク質間相互作用（PPI）の研究に使用される現在の方法のほとんどは、タンパク質レベルがタンパク質の過剰発現によって人為的に増加するシステムに基づいています。タンパク質の過剰発現は、多くの場合、時間的および空間的アーティファクトから生じる非生理学的結果につながります。ここでは、HIF-1αとARNTの相互作用を示すために、内因性核タンパク質を使用した低酸素治療後の修正共免疫沈降プロトコルについて説明します。このプロトコルでは、低酸素細胞を低酸素条件下で採取し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）洗浄バッファーも、再酸素化中のタンパク質分解またはタンパク質複合体の解離を緩和するために使用する前に低酸素状態に均衡化されました。さらに、その後、核画分を抽出して、内因性核タンパク質を濃縮および安定させ、タンパク質の過剰発現中によく見られる可能性のある偽の結果を回避しました。このプロトコルを使用して、低酸素条件下で転写因子と転写共調節因子との間の内因性およびネイティブの相互作用を実証できます。

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated α subunit (HIF-1α) and constitutively expressed β subunit (HIF-1β) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1α stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1α and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1α and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.