新規分子ローターは、蛍光インターカレータ変位アッセイを使用したp53-DNA相互作用の検出を促進します。

DNAへのp53結合を検出するためのプローブとして、蛍光分子ローターの使用を調査しました。これらは、かつてかつれ内電荷移動（TICT）を受けるフルオロフォアのクラスです。それらは、自由に回転する立体構造では非蛍光であり、平面の立体構造に制限された場合、蛍光の増加を経験します。DNA塩基対間の分子ローターの挿入が蛍光ターンオン信号になると仮定しました。DNA結合タンパク質による変位により、シグナルの測定可能な損失は、蛍光インターカレータ変位（FID）アッセイでの分子ローターの使用を容易にします。プローブのパネルは、さまざまなDNA応答要素にわたって確立されたP53モデルシステムを使用して尋問されました。アクリジンオレンジDNAインターカレーティング基（AO-R）を組み込んだ新規の容易に合成可能な分子ローターは、FIDアッセイに他の従来の染料を上回りました。p53配列特異的DNA相互作用の相対測定と、癌関連p53変異体の支配的陰性効果の研究を可能にしました。さらなる用途では、AO-Rは、生きたゼブラフィッシュ胚のアポトーシス細胞を染色するのにも役立つことが証明されました。

We have investigated the use of fluorescent molecular rotors as probes for detection of p53 binding to DNA. These are a class of fluorophores that undergo twisted intramolecular charge transfer (TICT). They are non-fluorescent in a freely rotating conformation and experience a fluorescence increase when restricted in the planar conformation. We hypothesized that intercalation of a molecular rotor between DNA base pairs would result in a fluorescence turn-on signal. Upon displacement by a DNA binding protein, measurable loss of signal would facilitate use of the molecular rotor in the fluorescent intercalator displacement (FID) assay. A panel of probes was interrogated using the well-established p53 model system across various DNA response elements. A novel, readily synthesizable molecular rotor incorporating an acridine orange DNA intercalating group (AO-R) outperformed other conventional dyes in the FID assay. It enabled relative measurement of p53 sequence-specific DNA interactions and study of the dominant-negative effects of cancer-associated p53 mutants. In a further application, AO-R also proved useful for staining apoptotic cells in live zebrafish embryos.