固体ナノポアを含むDNA上のCRISPR-DCAS9の検出

固体ナノポアは、疾患検出の診断を含むバイオセンシングの有望なプラットフォームとして浮上しています。ここでは、標的DNA配列に特異的に結合する配列固有のRNA誘導タンパク質システムであるCRISPR-DCAS9を検出するNanopore実験を示します。CRISPR-CAS9はその遺伝子編集の可能性で称賛されていますが、ここで採用されているCRISPR-DCAS9バリアントはDNAを切断せず、代わりにユーザー定義の結合部位で密接に結合したままであるため、バイオセンシングの優れたターゲットを提供します。ナノポアの実験では、CRISPR-DCAS9タンパク質が、ナノポアを通過するDNA分子のイオン電流遮断シグナルの上に現れる局所的なスパイクとして観察します。タンパク質は、標的配列の容易な識別を可能にする顕著な封鎖信号を示します。ナノポアの実験に必要な高塩条件（1 M LICL）でさえ、DCAS9タンパク質は安定して結合したままであることがわかりました。ターゲットシーケンスの結合位置は、DNA信号に沿ったスパイク位置から読み取ることができます。このナノポアに基づいたCRISPR-DCAS9バイオセンシングアプローチの応用は、迅速な病気の鎖同定、抗生物質耐性検出、ゲノムタイピングなどのDNAタイピングベースの診断における診断におけるアプローチを予想しています。

Solid-state nanopores have emerged as promising platforms for biosensing including diagnostics for disease detection. Here we show nanopore experiments that detect CRISPR-dCas9, a sequence-specific RNA-guided protein system that specifically binds to a target DNA sequence. While CRISPR-Cas9 is acclaimed for its gene editing potential, the CRISPR-dCas9 variant employed here does not cut DNA but instead remains tightly bound at a user-defined binding site, thus providing an excellent target for biosensing. In our nanopore experiments, we observe the CRISPR-dCas9 proteins as local spikes that appear on top of the ionic current blockade signal of DNA molecules that translocate through the nanopore. The proteins exhibit a pronounced blockade signal that allows for facile identification of the targeted sequence. Even at the high salt conditions (1 M LiCl) required for nanopore experiments, dCas9 proteins are found to remain stably bound. The binding position of the target sequence can be read from the spike position along the DNA signal. We anticipate applications of this nanopore-based CRISPR-dCas9 biosensing approach in DNA-typing based diagnostics such as quick disease-strain identification, antibiotic-resistance detection, and genome typing.